Closed System Cell Culture Protocol Mit HyperStack Schiffe mit gasdurchlässigen Material Technology

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die korrekte Anwendung der Corning Hypers-Stack-Gefäße im geschlossenen System zu demonstrieren. Dies wird zunächst erreicht, indem die Gefäße über die Schwerkraftzufuhr mit Zellkulturmedium beimpft und befüllt werden. Anschließend wird die Zellsuspension in jeder der Schichten isoliert und die Zellen inkubiert.

Nach der Inkubation wird das verbrauchte Medium entfernt. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Zellen aus den Hypers-Stack-Gefäßen zu gewinnen. Abschließend werden Gassdiffusionsergebnisse erhalten, um die Fähigkeit der Zellen nachzuweisen, während des Wachstums bis zur Konfluenz Sauerstoff zu nutzen, wenn das geschlossene Hypers-Stack-System verwendet wird.

Der Hauptvorteil des Hypers-Stack-Gefäßes mit gasdurchlässigem Material liegt darin, dass es eine vergrößerte Oberfläche für das Zellwachstum bietet. Indem der Kopfraum im Gefäß eliminiert wird, wird mein Kollege p pardo nun ein Protokoll für ein geschlossenes System zur Verwendung des Hypers-Stack-Gefäßes demonstrieren. Das Hypers-Stack-Gefäß besteht aus einem Stat, der die einzelne Zellkulturkammer darstellt und aus der oberen Platte sowie einem gasdurchlässigen Film aufgebaut ist.

Die Zellen werden in diesem Kompartiment kultiviert. Der Flüssigkeitsverteiler verbindet jede der Etten-Schichten innerhalb eines Moduls miteinander. Module werden mit Schläuchen verbunden, um Gefäße in Vielfachen von 12 Schichten zu bilden.

Mittels des Verteilers kann der Benutzer eine einzige Fluidmanipulation an dem gesamten Gefäß vornehmen. Der Luftverteiler verbindet ebenfalls die Stat-Schichten miteinander, dient jedoch dazu, Luft aus dem Gefäß zu verdrängen, wenn Flüssigkeiten hinzugefügt werden, und verfügt über eine Füllleitung, die beim Befüllen zwischen den einzelnen Schichten verwendet wird. Die Stat-Schicht ist ein luftgefüllter Hohlraum, der als trachealer Raum bezeichnet wird und den Gasaustausch über die gasdurchlässige Folie jeder Schicht ermöglicht.

Die Flüssigkeitsmanipulationsleitung ist mit dem Flüssigkeitsverteiler verbunden und stellt eine anpassbare Komponente dar, die für alle Fluidmanipulationen im geschlossenen System verwendet wird, um überschüssige Luft abzulassen, während die Sterilität aufrechterhalten wird. Es wird eine Entlüftungsleitung verwendet. Die Entlüftungsleitung ist mit dem Luftverteiler verbunden und enthält einen Luftfilter.

Verbunden mit der Flüssigkeitsmanipulationsleitung ist die Spülleitung und der Filter, die verwendet werden, um die Flüssigkeit aus der Flüssigkeitsmanipulationsleitung zu entfernen, nachdem der Behälter befüllt wurde. Ebenfalls in diesem Protokoll verwendet wird der Corning Stack-Manipulator oder CSM, ein Handhabungsgerät, das beim Platzieren der Behälter in die korrekten Positionen während der Anwendung hilft. In dieser Demonstration wird die Zellkultur im geschlossenen System für einen gasdurchlässigen 36-Schichten-Behälter gezeigt.

Bei Verwendung eines CSM finden sich jedoch Details zur Durchführung dieses Verfahrens an einem 12-Schicht-Behälter mit einem Füllkeil im beigefügten schriftlichen Protokoll. Bereiten Sie zunächst 3,9 Liter abgepacktes Medium vor, bevor Sie die Mediaröhre inoculieren. Verbinden Sie die Serum- mit der Mediatasche und mischen Sie gründlich, um die gewünschte Serumkonzentration zu erreichen.

Klemmen Sie mithilfe großer Beutelklemmen etwa 300 Milliliter Medium im Beutel ab. Dadurch wird sichergestellt, dass alle inkulierten Zellen während des Befüllens verwendet werden und keine im Mediumbeutel verbleiben. Stellen Sie den Beutel auf einen Beutelständer, um das Medium zu inkulieren.

Füllen Sie eine mit Schlauch verbundene Spritze mit der Zellsuspension. Befestigen Sie die Spritze mit der Zellsuspension an der Medium-Tüte durch Schlauchschweißen. Drei über 16 Zoll Schlauch von der Spritze zur Tüte.

Injizieren Sie die Zellsuspension in den Medienbeutel und mischen Sie sie gründlich. Der beimpfte Medienbeutel kann mittels Schlauchschweißen oder mit Mehrzweckverbindern an den 3/8-Zoll-Flüssigkeitsschlauch des Gefäßes angeschlossen werden. Heute werden wir das Schlauchschweißen verwenden.

Schließen Sie die Klammern an den Flüssigkeitsmanipulations- und Nachführrohren des Gefäßes. Stellen Sie das 36-Schicht-Gefäß in eine CSM in die Ladeposition. Haken Sie das Entlüftungsfilterrohr in die Halteklammer an der CSM ein.

Schließen Sie den Deckel fest und bewegen Sie das CSM in die Füllposition, um den Luftfilter in die höchste Position zu bringen und so eine Benetzung während des Füllvorgangs zu verhindern. Der 10-Grad-Winkel ermöglicht zudem die Gleichgewichtseinstellung der Flüssigkeit zwischen den Schichten während des Füllens, wobei Luft aus der Füllleitung entweicht. Positionieren Sie die Mediumsbeutel auf derselben Höhe wie das Gefäß, während die Klemme des Spülschlauchs geschlossen bleibt.

Öffnen Sie die Schlauchklemme für die Flüssigkeitsabgabe und die Beutelklemme des Mediums, um den Flüssigkeitsfluss in das Gefäß zu ermöglichen. Heben Sie mithilfe des Beutelständers den Mediumsbeutel an, um den Einfluss der Zellsuspension in das Gefäß zu unterstützen. Füllen Sie das Gefäß, bis das gesamte inoculierte Medium in das Gefäß eingeflossen ist.

Im oberen Bereich des Mediumsacks sollten sich noch 300 Milliliter Medium befinden. Entfernen Sie die Klemme vom Mediumsack, um die Befüllung des Gefäßes fortzusetzen, wenn die Flüssigkeit dem oberen Luftverteiler nahekommt. Verringern Sie die Befüllgeschwindigkeit, indem Sie den Mediumsack absenken, um eine Überfüllung zu verhindern.

Bringen Sie den Flüssigkeitspegel langsam bis zur Füllmarkierung und klemmen Sie die Flüssigkeitsmanipulationsleitung ab. Bringen Sie das Gefäß im CSM in die Isolationsposition, wobei beide Manifold-Sätze in die höchste Position gebracht werden. Senken Sie die Mediumsbeutel unter die Höhe des Gefäßes ab.

Halten Sie den Spülfilter in aufrechter Position und öffnen Sie die Klemme des Spülrohrs. Dadurch wird das Medium aus dem Flüssigkeitsmanipulationsrohr zurück in die Medium-Tüte geleitet. Sobald das Schlauchsystem leer ist, schließen Sie die Klemme am Schlauch der Medium-Tüte.

Halten Sie den Jagdrohrenfilter in aufrechter Position. Öffnen Sie die Klemme am Flüssigkeitsmanagementschlauch des Behälters, um der verbleibenden Flüssigkeit das Einlaufen und Ausgleichen im Behälter zu ermöglichen. Warten Sie ein bis zwei Minuten, bis dies eingetreten ist.

Drehen Sie als Nächstes das Gefäß im CSM, sodass sich die Verteiler auf der linken Seite befinden. Senken Sie das Gefäß in die Ladeposition am CSM ab. Schließen Sie die Klemmen sowohl an der Jagd- als auch an der Flüssigkeitsführungsschlauchleitung.

Die Medientasche kann nun vom Gefäß entfernt werden oder für einen späteren Zeitpunkt im Ernteverfahren daran belassen werden. Zum Aufbewahren der befestigten Medientasche rollen Sie diese zusammen und legen sie unter die Haltebänder im Ablagefach des Gefäßes. Schließlich bewegen Sie das Gefäß in den Inkubator. Achten Sie beim Tragen des Gefäßes darauf, dass keine Flüssigkeit in den Luftentlüftungsfilter gelangt.

Dies wird erreicht, indem das Manifold-Ende leicht nach oben gekippt wird. Um mit dem Ernteverfahren zu beginnen, verschweißen Sie das Zellverbandlösungsröhrchen und die Abbruchbeutel miteinander, um die Erntesackanordnung zu bilden. Stellen Sie sicher, dass alle Schlauchklemmen geschlossen sind. Entnehmen Sie das Gefäß aus dem Inkubator und stellen Sie es in der CSM in die Ladeposition.

Lösen Sie die Medientasche von unterhalb der Haltebänder und hängen Sie sie an der Tasche auf. Stellen Sie sich daneben, ziehen Sie den Deckel fest, um das Gefäß zu sichern. Haken Sie das Entlüftungsrohr in die Halteklammer ein und bewegen Sie das CSM in die Füllposition.

Stellen Sie sicher, dass der Mediumsbeutel auf dem Beutelständer tiefer hängt als das Gefäß. Öffnen Sie die Klemme an der Schlauchleitung des Mediumsbeutels und an der Flüssigkeitsdosierschlauchleitung des Gefäßes, um das Medium in den angeschlossenen Beutel fließen zu lassen. Sobald das Gefäß etwa zu drei Vierteln geleert ist, ändern Sie die CSM-Einstellungen auf die endgültige Leerposition.

Wenn das Gefäß und die Flüssigkeitsführungsschläuche leer sind, heben Sie den Schlauch an, um das Medium an der Klemme des Schlauchs für den verbrauchten Mediumbeutel vorbeizuleiten. Schließen Sie dann sowohl die Klemme am Flüssigkeitsführungsschlauch als auch die Klemme am Schlauch des verbrauchten Mediumbeutels. Ersetzen Sie den verbrauchten Mediumbeutel durch die Erntetaschenanordnung mittels Schlauchschweißen.

Heben Sie die Höhe der Zell-Dissociationsbeutelvorrichtung mithilfe des Beutelständers über die Höhe des Gefäßes an. Bringen Sie das CSM in die Füllposition. Öffnen Sie die Schlauchklemme der Zell-Dissociationslösung und die Klemme der Erntebag-Vorrichtung, und leiten Sie die Lösung in das Gefäß um.

Wenn die Übertragung abgeschlossen ist, schließen Sie die Klemmen an der Flüssigkeitsmanipulationsleitung und an der Leitung für die Zelldissoziationslösung. Bringen Sie anschließend das CSM in die Ladeposition, während Sie den horizontalen Positionierhebel geöffnet halten. Bewegen Sie das Gefäß vorsichtig mit Hilfe des Rads von Seite zu Seite, um die Lösung gleichmäßig über die Zellschichten zu verteilen.

Das Gefäß kann gelegentlich während des Schaukelns in die Füllposition zurückgebracht werden, um eine gleichmäßige Verteilung der Lösung sicherzustellen. Sobald die Lösung ausreichend verteilt ist, lösen Sie den Hebel am CSM, um die Füllposition zu verriegeln. Belassen Sie das Gefäß während der erforderlichen Dissoziationszeit der Zellen in dieser Position.

Verwenden Sie die Trübung als Orientierungshilfe zur Beurteilung der Zellablösung. Sobald die Zellen abgelöst sind, bewegen Sie das CSM in die Ladeposition. Öffnen Sie die Klemme des Abkühlbeutels und die Klemme der Flüssigkeitsmanipulationsleitung, um das Abkühlmedium in das Gefäß strömen zu lassen.

Schließen Sie die Klemme an dem Flüssigkeitsmanipulations-Schlauch. Sobald die Übertragung abgeschlossen ist, bringen Sie das CSM in die Ladeposition zurück und halten Sie den horizontalen Positionierhebel fest, um den Behälter von Seite zu Seite zu schwenken. Senken Sie mithilfe des Beutelständers die Position der Erntebag-Anordnung unter das Niveau des Behälters.

Stellen Sie das CSM auf die leere Position ein. Öffnen Sie die Klammer des Flüssigkeithandhabungsschlauchs des Behälters und überführen Sie die Zelllösung zurück in den Quench-Beutel. Bringen Sie das CSM in die Ladeposition zurück und trennen Sie die Erntebag-Vorrichtung vom Behälter mithilfe eines Schlauchversiegelers.

Jetzt ist die Zellsuspension bereit für die Verarbeitung in herkömmlichen Zellkultursystemen. Bei Verwendung von Headspace wird der Sauerstoff im Medium im Durchschnitt um 50 % über einen Zeitraum von drei Tagen verbraucht. In der Kultur zeigt diese Abbildung die Abnahme der Sauerstoffkonzentration in Milligramm pro Liter auf der Ebene der Zellen über die Zeit im selben Kultursystem; der Sauerstoffgradient über eine Mediumshöhe von drei Millimetern ist an der Grenzfläche zwischen Medium und Headspace nahezu 50 % größer als an der Zellschicht.

Der Sauerstoffanteil im trachealen Raum des Hypers-Stapels während des Zellwachstums ist dargestellt. Die Abbildung zeigt, dass über einen Zeitraum von 96 Stunden der Sauerstoffanteil zwischen den Schichten, der jede gasdurchlässige Folienunterseite versorgt, konstant bleibt. Dies verdeutlicht die Fähigkeit der Zellen, während des Wachstums bis zur Konfluenz auf Sauerstoff zuzugreifen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das Corning Hypers stack-Gefäß im geschlossenen System befüllt und Ernte gewinnt.