Visualizing RNA Localization in Xenopus Oozyten

Bei diesem Verfahren werden fluoreszenzmarkierte RNA-Transkripte in XUS-Zellen injiziert und ihre Lokalisation wird überwacht. Zunächst wird die RNA mit fluoreszierenden Nukleotiden markiert.

Bei einer In-vitro-Transkriptionsreaktion wird die RNA anschließend in eine Mikroinjektionsvorrichtung aufgenommen. Die Oozyten werden auf eine Injektionsschale gegeben und vorsichtig mikroinjiziert. Abschließend werden die Oozyten kultiviert, um die RNA-Lokalisation vor der Bildgebung am konfokalen Mikroskop stattfinden zu lassen.

Hallo, ich bin James Gagnan aus dem Labor von Dr. Kimberly Mallory am Department für Molekularbiologie, Zellbiologie und Biochemie der Brown University. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Visualisierung der subzellulären RNA-Lokalisation in Xap-Oozyten. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die RNA-Architektur und die Proteinfaktoren zu untersuchen, die für die RNA-Lokalisation während der frühen Wirbeltierentwicklung erforderlich sind.

Beginnen wir nun. Transkribieren Sie zu Beginn dieses Verfahrens mRNA, die wie in dem begleitenden schriftlichen Protokoll beschrieben sowohl radioaktiv als auch fluoreszenzmarkiert ist. Geben Sie DS hinzu, um die Matrizen-DNA abzubauen, und stoppen Sie anschließend die Reaktion durch Zugabe von EDTA.

Entfernen Sie nicht eingebaute Nukleotide und andere kleine Moleküle, indem Sie die Probe durch eine G-50-Säule zentrifugieren. Die RNA wird anschließend durch Ethanolpräzipitation konzentriert, gewaschen und resuspendiert. Nach Bestimmung der Konzentration mittels Szintillationszählung verdünnen Sie die RNA auf 50 Nanomolar und lagern sie in Aliquots zu je fünf Mikroliter bei minus 80 Grad Celsius.

Wenn Sie bereit sind, die Mikroinjektion durchzuführen, tauen Sie ein Eloqua der markierten RNA auf und denaturieren sie bei 70 Grad Celsius für fünf Minuten. Anschließend zentrifugieren Sie zehn Minuten bei maximaler Drehzahl in einem Mikrozentrifugengerät bei Raumtemperatur, um Partikel zu entfernen, und stellen Sie es auf Eis. Danach isolieren Sie die Cytes, indem Sie Stücke des Xap-Post-Lavu-Ovars in einen 50-Milliliter-Kegelkolben mit 25 Millilitern einer Drei-Milligramm-pro-Milliliter-Lösung geben.

Kollagenase in einem 0,1 molaren Kaliumphosphatpuffer bei pH 7,4. Vorsichtig bei 18 Grad Celsius schütteln, da Unterschiede zwischen Chargen auftreten können. Die Behandlungszeit mit Kollagenase kann variieren und sollte sorgfältig durch visuelle Kontrolle überwacht werden.

Um eine vollständige Entlaubung sicherzustellen, weiterhin 15 Minuten schütteln oder bis die Oozyten sichtbar von der Eierstöcke getrennt sind; anschließend die Oozyten auf den Boden des kegelförmigen Reaktionsgefäßes absinken lassen. Die Lösung entfernen und durch MBSH-Puffer ersetzen. Diesen Schritt wiederholen, insgesamt dreimal waschen, wobei zwei weitere Wäschen erfolgen.

Als Nächstes sortieren Sie Stufe-drei-bis-vier-Zygoten manuell unter einem Standard-Lichtmikroskop in MBSH-Puffer. Zygoten der Stufe drei sind vollständig opak, jedoch weiß. Zygoten der Stufe vier hingegen sind etwas größer und mit Pigment gezeichnet.

Zellen, die leicht transparent sind, sind zu jung, und Zellen, die vollständig pigmentiert sind oder eine polarisierte Pigmentverteilung aufweisen, sind zu alt. Bereiten Sie abschließend die Nadeln für die Mikroinjektion vor, indem Sie dreieinhalb Zoll lange Kapillaren ziehen und abschrägen, um Nadeln mit einem Außendurchmesser von etwa 0,05 Millimetern herzustellen. Da nun die mRNA, Oozyten und Nadeln bereit sind, fahren Sie mit der Mikroinjektion fort.

Kalibrieren Sie zunächst die Nadel mit entionisiertem Wasser, um zwei Nanoliter pro Injektion abzugeben. Beladen Sie die Nadel mit einem gasgesteuerten Mikroinjektor und kalibrieren Sie die Tropfengröße mithilfe eines Mikrometers. Nach der Kalibrierung beladen Sie die Nadel erneut mit der zu injizierenden RNA. Platzieren Sie danach die sortierten Oozyten in einer Injektionsschale mit MBSH-Puffer; die Schale enthält eine Schicht aus schwarzem Schaumgummi.

Die weißen Zellen heben sich deutlich vor einem schwarzen Hintergrund ab. Injizieren Sie dann vorsichtig jede Oozyte mit zwei Litern RNA bei 50 Nanomolar. Achten Sie darauf, dass jede Oozyte nur einmal injiziert wird, und überprüfen Sie die Nadel nach der Injektion regelmäßig auf Verstopfungen.

Drücken Sie die restliche RNA aus, spülen Sie die Nadel mit entionisiertem Wasser aus und laden Sie die nächste RNA für die Injektion auf. Nach der Injektion überführen Sie die injizierten Zellen in eine Vertiefung einer sterilen 24-Loch-Platte, bis zu tausend pro Vertiefung. ZELLEN können pro Vertiefung kultiviert werden.

Entfernen Sie den Puffer und ersetzen Sie ihn durch 400 µL Zellkulturmedium pro Vertiefung. Anschließend stellen Sie die Kulturplatte in einen Plastikbehälter mit einem nassen Papiertuch, um während der Kultivierung eine feuchte Umgebung aufrechtzuerhalten. Inkubieren Sie die Oozyten bei 18 °C für Zeiträume zwischen acht und 48 Stunden nach der gewünschten Inkubationszeit. Die Oozyten können nach der Inkubation der injizierten Oozyten für die Mikroskopie vorbereitet werden.

Sortieren Sie tote Oozyten aus und geben Sie die überlebenden Oozyten in Glasfläschchen. Es wird routinemäßig eine Überlebensrate von mehr als 90 % der Oozyten beobachtet. Ersetzen Sie den Puffer durch M-E-M-F-A-Fixansatz und schütteln Sie die Zellen 20 Minuten lang.

Schützen Sie die Oozyten nach Beendigung der Fixierungszeit vor Sonnenlicht während der Fixierung. Waschen Sie die Oozyten, indem Sie das Fixiermittel entfernen und durch ein gleiches Volumen MBSH-Puffer ersetzen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt einmal, insgesamt zwei Waschungen.

Als Nächstes waschen Sie die Oozyten in wasserfreies Methanol. Entfernen Sie zunächst die Hälfte des Volumens und ersetzen Sie es durch Methanol. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zweimal.

Nach diesen Waschungen entfernen Sie die gesamte Lösung und ersetzen sie durch Methanol. Wiederholen Sie diesen Methanolwaschschritt noch einmal. Die fixierten und dehydrierten Oozyten können bis zur Bildaufnahme bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden.

Vor der Bildgebung fügen Sie Marie's Klärmedium einem Glasboden-WPI-Fluorodisch hinzu, um die Bildgebungsoberfläche zu bedecken. Überführen Sie die Oozyten vorsichtig aus Methanol in den Fluorodisch, wobei das übertragene Methanolvolumen minimiert werden sollte. Bilden Sie die Oozyten auf einem invertierten konfokalen Mikroskop ab; sowohl ein Zeiss LSM 510 als auch ein Aica TCS SP liefern gute Ergebnisse. Nun zeigen wir einige repräsentative Bilder der subzellulären RNA-Lokalisation unmittelbar nach der Mikroinjektion. Acht Stunden nach Kultivierung ist fluoreszierende RNA im Kern einer fluoreszenzmarkierten Kontrolle sichtbar.

RNA ist gleichmäßig im Zytoplasma der Oozyte verteilt sichtbar. Allerdings kann eine fluoreszenzmarkierte RNA, die Sequenzen enthält, die die Transportmaschinerie rekrutieren, während der subzellulären Lokalisierung zur Vegetalpolregion der Oozyte beobachtet werden. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man fluoreszenzmarkierte RNAs in Oozyten mikroinjiziert und die RNA-Lokalisierung mittels konfokaler Mikroskopie beobachtet.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, diethylpyrokarbonatbehandelte Lösungen zu verwenden, um RNA-Kontaminationen der Kultur zu vermeiden, Ihre Zellen in OCM mit Antibiotika zu kultivieren und Ihre Zellen nach Möglichkeit vor Sonnenlicht zu schützen, um Photo-Bleichen zu verhindern. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.