Der Ausarbeitung der einzelnen Drosophila Ei Chambers für Live-Imaging

Das Ziel des folgenden Experiments besteht darin, dynamische Prozesse in lebenden Drosophila-U-Stellen aufzuzeichnen. Dies wird erreicht, indem zunächst intakte Ovarien aus gut genährten zweitägigen weiblichen Fliegen isoliert werden. Als zweiter Schritt werden einzelne Follikel aus den Ovarien gewonnen, um die Eikammern abzubilden.

Wenn sie ein geeignetes fluoreszierendes Protein exprimieren, können einzelne Eikammern entweder direkt abgebildet werden oder zusätzlichen Manipulationen unterzogen werden, wie beispielsweise der Mikroinjektion fluoreszierender Marker vor der Bildaufnahme. Letztendlich können durch die Analyse der Filmsequenzen die dynamischen Wechselwirkungen intrazellulärer Komponenten aufgezeigt werden. Diese Methode hat uns geholfen, einige zentrale Fragen auf dem Gebiet des RNA-Transports und der lokalisierten Translation zu beantworten.

Beispielsweise, wie wird die Expression von Proteinen, die den Körperplan anlegen, in Zeit und Raum in der lebenden Beobachtung reguliert? Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da sie erhebliche Schnelligkeit und Geschicklichkeit erfordert. Beide Übung und bessere Ergebnisse werden erreicht.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Handhabung der Eikammern schwer allein durch Text zu vermitteln ist und da technische Erfahrung und sichere Handgriffe erforderlich sind. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie einen kleinen Tropfen Halocarbon-Öl auf einen Deckglas geben und beiseitelegen. Anschließend betäuben Sie die vorbereiteten Fliegen mit Kohlendioxid.

Verwenden Sie eine scharfe Feinnasenzange, um eine fette weibliche Fliege am vorderen Abdomen zu fassen. Fassen Sie nicht in der Mitte des Abdomens zu. Halten Sie das Weibchen etwa zwei bis drei Zentimeter über die vorbereitete Deckglasplatte.

Entfernen Sie mit einem zweiten Paar Pinzetten das Gewebe am äußersten Hinterende des Weibchens. Dies schließt normalerweise Darmgewebe mit sauberen Pinzetten ein. Massieren Sie vorsichtig den Bauch vom vorderen zum hinteren Ende, ähnlich wie man Zahnpasta aus einer Tube drückt.

Die Eierstöcke sehen aus wie große undurchsichtige Strukturen und bleiben an der Spitze der Pinzette haften. Sammeln Sie die Eierstöcke, indem Sie sie mit dem Kohlenstofföl-Halo auf dem Objektträger berühren. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis vier bis sechs Eierstöcke gesammelt sind.

Vor der Isolierung der Antennen. Stellen Sie die Lichtquelle am Mikroskop so ein, dass die Beleuchtung den Objektträger in flachem Winkel trifft und kontrastreiche Schatten auf dem Gewebe erzeugt. Bei der Dissektion der Fliegen ist es sehr wichtig, die richtigen Werkzeuge zu verwenden.

Der Zeiger, den wir verwenden, ist nicht zu scharf, sodass er das Gewebe beschädigt, sondern ziemlich stumpf, damit wir die Pinzette, die wir benutzen, greifen können. Auch diese sollte nicht zu scharf sein, um die Gewebe nicht zu beschädigen, aber gerade fein genug, um Dinge manipulieren zu können, ohne das Werkzeug zu verbiegen. Es ist außerdem sehr wichtig, saubere Instrumente zu haben, daher reinigen wir sie während des gesamten Verfahrens regelmäßig mit geschlossenen Pinzetten.

Trennen Sie die beiden Ovarien, indem Sie das verbindende Gewebe am hinteren Ende entfernen. Am hinteren Ende befinden sich die am weitesten entwickelten Eikammern. Richten Sie ein Ovarium horizontal aus, wobei die jüngsten Eikammern in Richtung Ihrer dominanten Hand zeigen.

Dann greifen Sie vorsichtig das hintere Ende am verbleibenden Bindegewebe und verwenden Sie eine feine Nadel aus Wolfram oder eine Präpariernadel, um einzelne Eikammern vom Jamar-Stadium bis zum Stadium 10 herauszulösen, die sich voneinander trennen; ältere Eikammern bleiben jedoch mit dem Ovar verbunden. Ziehen Sie mit der Nadel vorsichtig 15 bis 25 getrennte Eikammern in die Mitte des Öltropfens. Falls mehr als ein Ovar präpariert werden muss, wählen Sie eines aus einer anderen Fliege.

Entfernen Sie überschüssiges Ovarialgewebe und arbeiten Sie schnell, da die Zellen aufgrund von Stress beginnen, phänotypische Veränderungen aufzuweisen. 40 Minuten nach der Dissektion aus dem Eierstock entfernen Sie das überschüssige Ovarialgewebe aus dem Öl. Verwenden Sie saubere Instrumente für die Injektion von Zellen im mittleren Stadium und richten Sie die Arealen senkrecht zur langen Achse des Deckgläschens aus. Um Eikammern im späten Stadium zu isolieren.

Eine andere Methode ist erforderlich, um das hintere Ovarabschnitt wie zuvor beschrieben zu fassen. Führen Sie die Präpariernadel in das hintere Ende des Ovars in der Nähe der Pinzette ein. Um zu vermeiden, dass die Eikammern durchstochen werden, bringen Sie die Nadel zwischen den Eikammern im fortgeschrittenen Entwicklungsstadium ein.

Ziehen Sie die Dissektionsnadel durch die Ovarien, bis sie an den Ei-Kammern im frühen Stadium austritt. Wenn der Vorgang korrekt durchgeführt wird, löst die Sonde das Bindegewebe, das die Zellhaufen und die Ei-Kammern im späten Stadium fixiert, heraus. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis sich die Zellhaufen auf dem Deckglas ausgebreitet haben.

Wenn die Eikammern nicht mehr übereinander gestapelt sind, ist dieser Schritt abgeschlossen. Mit einer Präpariernadel die Eikammern im fortgeschrittenen Stadium trennen, um die Positionierung von Stadium 14 für die Bildgebung zu erleichtern. Bei den Halskammern mit der Pinzette die dorsalen Anhänge erfassen.

Bereiten Sie die zu injizierenden Lösungen vor, indem Sie diese kurz mit hoher Geschwindigkeit zentrifugieren. Dadurch werden feste Ablagerungen abgetrennt, die die Injektionsnadel verstopfen könnten. Laden Sie anschließend die Injektionsnadel mit einer Ladespitze und befestigen Sie die geladene Injektionsnadel vorsichtig am Injektor.

Platzieren Sie nun ein kleines Glasstück neben den Proben und befestigen Sie den Objektträger auf dem Mikroskoptisch. Das Glas dient als Wand, um zu brechen oder zu trennen. Ziehen Sie die Nadel heraus.

Bereiten Sie das Mikroskop und die Injektionsvorrichtung für das Experiment vor. Achten Sie darauf, die Nadelspitze nicht zu beschädigen. Verwenden Sie nach Möglichkeit einen automatisierten Mikroskoptisch mit Punkte-Anfahrfunktion, um alle Zellen vom Stadium acht und Stadium neun für die Injektion zu markieren.

Senken Sie nun die Injektionsnadel ab, bis sie das Öl berührt. Wählen Sie den ersten Punkt aus der Liste der markierten Punkte aus und fokussieren Sie auf den Cyten. Senken Sie die Nadel manuell ab, bis sie sich in derselben Fokusebene wie der Cyt befindet.

Verwenden Sie die Steuerelemente des Manipulators, um die Spitze der Injektionsnadel so zu bewegen, dass sie sich innerhalb der U-Stelle befindet. Oft ist eine schnelle Stichbewegung erfolgreicher als eine langsame. Sobald die Nadel im Inneren ist, geben Sie ein kleines Volumen aus der Nadel ab und bewerten Sie die Wirkung visuell.

Wiederholung ist erforderlich. Wenn die Injektion erfolgreich ist, wird das Cytoplasma innerhalb der Zelle verdrängt. Die genaue Menge der injizierten Flüssigkeit ist schwer zu quantifizieren.

Um das injizierte Volumen zu erhöhen, passen Sie entweder den Druck oder die Dauer des Injektionsimpulses an. Brechen Sie die Nadelspitze leicht ab, um die Nadelöffnung geringfügig zu vergrößern, oder verwenden Sie einfach mehrere Injektionsimpulse, bevor Sie den nächsten Cyt auswählen. Heben Sie die Injektionsnadel so weit in das Öl an, dass sie nicht mit anderen Cytos kollidiert.

Umfangreiches Einstechen oder längeres Verweilen der Nadel im Cytoplasma schädigt die Eizelle erheblich. Arbeiten Sie daher schnell. Die Injektion sollte weniger als 10 Sekunden dauern.

Wenn ein Fehler gemacht wird, bewegen Sie sich zur nächsten Markierung an eine Stelle. Verschwenden Sie keine Zeit an beschädigte Stellen. Wenn die Nadel verstopft ist, bewegen Sie die Nadel zu dem gebrochenen Glasstück.

Bringen Sie die Nadel vorsichtig in die gleiche Fokusebene wie das Glas und stoßen Sie die Nadel sanft in das Glas hinein. Prüfen Sie, ob die Nadel frei ist, indem Sie den Injektionsknopf drücken und beobachten, ob Flüssigkeit aus der Nadelspitze austritt. Sobald alle US-Standorte injiziert wurden, bewegen Sie die Nadel manuell aus dem Öl heraus und positionieren Sie sie außerhalb des Strahlengangs des Mikroskops.

Stellen Sie sicher, dass die Ausrichtung sicher ist, um Augenschäden zu vermeiden, und schalten Sie die Lichter aus. Um die Geschwindigkeit der Fluoreszenzbildgebung zu erhöhen, ist dies zwingend erforderlich. Wenn zwischen der Isolierung der Eikammer und der Cyteninjektion eine Stunde oder länger vergangen ist, lassen sich die Cyten schwer injizieren und zeigen phänotypische Veränderungen im Zusammenhang mit Stress.

Ähnliche Probleme können bei unsachgemäßer Handhabung der Zelle oder Injektion von überschüssigen Volumina auftreten. Eikammern, die transgene fluoreszierende Proteine exprimieren, können ohne Injektion abgebildet werden. Die MS2-Markierung endogener RNA kann mit guten Ergebnissen mithilfe der Gewebegewinnungsverfahren unter Verwendung des vollständigen in vitro synthetisierten Verfahrens abgebildet werden.

Alexa, 5 46 kin, RNA wurde in eine ME 31 BGFP Eizelle injiziert, wobei sich die RNA im dorsal-anterioren Bereich der Zelle lokalisierte und einen Kap um den Zellkern bildete. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb von etwa 10 Minuten – vom Zeitpunkt der Dissektion bis zum Beginn der Bildaufnahme – durchgeführt werden. Achten Sie beim Durchführen dieses Verfahrens darauf, das Gewebe schnell, aber sorgfältig zu behandeln. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie dynamische Prozesse in lebenden Drosophila-Zellen aufgezeichnet werden können.