Mosaic Zebrafisch Transgenese zur Beurteilung Enhancer-Sequenzen

Hallo, ich bin Erica Kgi aus dem Labor von Shannon Fisher aus der Abteilung für Zell- und Entwicklungsbiologie an der University of Pennsylvania. Ich bin Chris Weber, ebenfalls aus dem Fisher-Labor. Und ich bin Shannon Fisher.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Analyse der Funktion von Enhancer-Elementen mittels Zebrafisch-Transgenese. Wir verwenden dieses Verfahren, um die transkriptionelle Regulation von Genen zu untersuchen, die bei der Skelettentwicklung wichtig sind. Beginnen wir also.

Um nicht-kodierende Sequenzen in der Umgebung von Kandidatengenen zu identifizieren, verwenden wir den Algorithmus fast cons, der als Track im uc SC Genombrowser verfügbar ist. Unser Hauptinteresse gilt Genen, die während der Skelettentwicklung exprimiert werden, doch derselbe Ansatz kann zur Untersuchung beliebiger Gene verwendet werden, die in der frühen Entwicklung exprimiert werden. In dem hier gezeigten Beispiel haben wir konservierte Sequenzen identifiziert.

Im Bereich um das humane Bumper-Gen herum untersuchen wir den gesamten Abschnitt bis zu den benachbarten Genen und bestimmen einen niedrigen, größenspezifischen Log-Score-Schwellenwert, der ungefähr den obersten 5 % der nicht-kodierenden Sequenz entspricht. Nach der Auswahl der Sequenzen entwerfen Sie Primer mithilfe von Primer3, um jede Sequenz aus humaner genomischer DNA zu amplifizieren. Die Primer sollten so gewählt werden, dass sie den konservierten Bereich sowie jeweils 30 oder mehr Basenpaare auf beiden Seiten amplifizieren. Amplifizieren Sie den Bereich von Interesse mit einer hochwertigen Polymerase unter Verwendung von humaner genomischer DNA und klonen Sie das amplifizierte Produkt mithilfe standardmäßiger molekularbiologischer Laborverfahren in einen Expressionsvektor.

Der in diesem Protokoll verwendete Vektor ist PG wc FOS GFPA Gateway. Zielvektor. Nach der Vektorerstellung Anweisung zum Transponieren erhalten.

Das für die Transposition erforderliche Enzym wird zunächst mit dem M message M machine Kit von Ambion und dem PGB 600-Plasmid vor der experimentellen Injektion in vitro transkribiert. Prüfen Sie jede Charge von Transposasen auf Wirksamkeit, indem Sie sie zusammen mit einem bekannten Enhancer wie dem Maus-Socks-10-Enhancer injizieren.

Ziehen Sie zur Vorbereitung der Injektionen die für die Mikroinjektion verwendeten Nadeln aus 1,2 Millimeter Außendurchmesser umfassendem Filament-Kapillarglas an einem Sutter P 97-Mikropipettenzieher. Verwenden Sie ein Programm, das eine stabile Spitze mit scharfem Konus erzeugt, um intakte Korionen mit einem scharfen Rasierklingenmesser und einem Objektträger-Mikrometer zu durchdringen. Brechen Sie die Spitzen von Hand unter einem Stereomikroskop auf einen Außendurchmesser von etwa 15 Mikrometern ab.

Die Nadeln können einen Tag lang in einer abgedeckten Halteschale aufbewahrt werden. Halten Sie die Zebrafischtierpopulation unter Standardbedingungen am Tag vor der Durchführung der Mikroinjektionen in einem regelmäßigen Hell-Dunkel-Wechsel mit 14 Stunden Licht aufrecht. Bereiten Sie die Fische für zeitgesteuerte Paarungen in kleinen Zuchtbehältern vor.

Stellen Sie drei Weibchen oder zwei Männchen pro Becken in parallelen Reihen am Morgen der Mikroinjektionen kurz nach Beginn des Lichtzyklus auf. Kombinieren Sie Männchen und Weibchen in sauberem, systembehandeltem Wasser zur Eierzeugung. Überprüfen Sie die Fische häufig und sammeln Sie die Eier innerhalb weniger Minuten nach der Abgabe, um gut synchronisierte Chargen zu erhalten.

Halten Sie die Eiablage für zwei bis drei Stunden aufrecht, indem Sie den ganzen Morgen über frische Fischgruppen mit einer breitlumigen Glas-Pasteurpipette mit fünf¼ Zoll Länge und einem Latexballon weiterhin kombinieren. Sortieren Sie die gesammelten Embryonen in 60 × 15 mm große Petrischalen, die teilweise mit Embryomedium gefüllt sind, jeweils in Gruppen von 50 Embryonen. Kennzeichnen Sie die Sammelzeit auf dem Deckel jeder Schale.

Speichern Sie für jeden gesammelten Gelege eine Schale mit 50 Embryonen als nicht injiziertes Kontrollgelege zwischen den Eiersammlungen auf. Bereiten Sie frische Injektionslösungen zu, indem Sie die folgenden Bestandteile in einem Mikrozentrifugenröhrchen mischen, und lagern Sie diese auf Eis. Legen Sie die Injektionsnadeln in Halteschalen und füllen Sie sie mit 1,5 bis zwei Mikrolitern Injektionslösung.

Durch das Pipettieren von 500 Nanoliter-Tropfen auf das breite Ende jeder Nadel. Die Flüssigkeit wird durch Kapillarwirkung zur Spitze gezogen. Bereiten Sie für jede Injektionslösung mindestens zwei Nadeln vor.

Laden Sie die gefüllte Nadel in den handgehaltenen Nadelspender einer pneumatischen Piko-Pumpe oder eines ähnlichen Druckinjektors ein. Konfigurieren und mit einem Stickstofftank gemäß den Herstelleranweisungen verbinden. Kalibrieren Sie die Injektionsvolumina, indem Sie den Durchmesser der in Mineralöl auf einem Objektträger mit Mikrometerskala ausgestoßenen Tröpfchen messen, typischerweise bei einer Injektionszeit von 120 Millisekunden.

Bei einem Druck von 20 PS erhalte ich mithilfe eines Stereomikroskops mit sechsfacher bis zehnfacher Vergrößerung einen Tropfen von etwa einem Nanoliter. Halten Sie das Embryo mit einer feinen Pinzette fest und schieben Sie die Injektionsnadel mit gleichmäßigem Druck durch die Chorionhülle in das Eiweiß eines Embryos im Ein-Zell- oder frühen Zwei-Zell-Stadium. Positionieren Sie die Nadelspitze im Eiweiß direkt unterhalb der Blastomeren, geben Sie etwa ein Nanoliter Injektionslösung ab und ziehen Sie die Nadel zurück. Für jeden Konstrukt injizieren wir mehr als oder gleich 200 Embryonen. Nach Abschluss der Injektionen sortieren Sie die Embryonen, indem Sie unbefruchtete Eier, beschädigte Embryonen sowie erfolglose Injektionen oder Embryonen ohne Phenolrot in den Blastomeren entfernen.

Anschließend inkubieren wir die Embryonen und das Embryonenmedium bei 28,5 Grad Celsius bis zum geeigneten Zeitpunkt für die Beobachtungen. Nun zeigen wir Ihnen einige repräsentative Ergebnisse von Enhancer-Elementen, die gewebespezifische Muster der GFP-Expression im Zebrafischembryo erzeugen. Wir untersuchen Gene, die während der Knochen- oder Knorpelentwicklung exprimiert werden.

Hier ist ein Beispiel für ein Enhancerelement stromaufwärts des acan-Gens, das die Expression in der kraniofazialen Knorpelgewebe drei Tage nach der Befruchtung reguliert. Hier ist ein weiteres Enhancer-Element, diesmal aus dem bumper-Gen, das die Expression in Knochenzellen reguliert. Bei fünf Tagen der vielen Enhancer, die wir identifiziert haben, finden wir kaum eine Korrelation zwischen der Lage relativ zum Gen und der Regulation der Expression.

Bei der Auswahl der zu testenden Sequenzen ist zu beachten, dass ein Enhancer, wie in diesem Embryo zu sehen, Hunderte von Kilobasen upstream oder downstream eines Gens oder in einem der Introns liegen kann. Ein erheblicher Teil der Sequenzen scheint die gewebespezifische Expression nicht zu regulieren. Diese zeigen oft nur sehr schwache Fluoreszenz oder vereinzelte Zellen an zwei häufigen Stellen für ektopische Expression, der Epidermis und der Skelettmuskulatur.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man potenzielle Enhancer-Elemente über Sequenzkonservierung identifiziert und ihre Funktion mittels Mosaik-Transgenese in Zebrafischen testet. Bei dieser Methode ist es wichtig, die Qualität Ihrer DNA und RNA für die Injektionen zu überprüfen. Achten Sie zudem darauf, alle injizierten Embryonen sorgfältig zu untersuchen, insbesondere wenn Sie die Expression nur in einer kleinen Gruppe von Zellen erwarten.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.