Umfassende Analyse der Zusammensetzung von pflanzlichen Zellwänden (Lignozellulose) Teil I: Lignin

Die Bestimmung des Ligningehalts und der Zusammensetzung pflanzlicher Zellwände beginnt mit getrocknetem Pflanzenmaterial, das verschiedenen Extraktionen unterzogen wird. Das resultierende Material besteht ausschließlich aus Zellwänden und wird anschließend aufgeteilt, um den Ligningehalt zu bestimmen. Das Wandmaterial wird einer Hydrolyse durch Acetylbromid unterzogen, und die gelösten Monomere werden mittels UV-Spektrometrie zur Ermittlung der Ligninzusammensetzung quantifiziert.

Das Zellwandmaterial wird durch Zytolyse hydrolysiert. Die gelösten Ligninbestandteile werden anschließend in ihre flüchtigen Trimethylsilan-Derivate umgewandelt, die mittels Gaschromatographie in Verbindung mit Massenspektrometrie getrennt und quantifiziert werden können. Die Bestimmung der Zusammensetzung der Matrixpolysaccharide und des Cellulosegehalts wird in einem anderen Video mit dem Titel „Umfassende Zusammensetzungsanalyse von Pflanzenzellwänden, Teil Zwei: Kohlenhydrate“ veranschaulicht.

Hallo, ich bin Marcus Pauley, Leiter der Wall-Analytik-Einrichtung am Great Lakes Bioenergy Research Center hier an der Michigan State University. Ich bin Cliff Foster, Leiter der analytischen Zellwand-Einrichtung. Wir zeigen Ihnen das Verfahren zur Bestimmung des Gehalts und der Zusammensetzung von Pflanzenbiomasseproben.

Pflanzen wandeln Lichtenergie der Sonne in chemische Energie wie Biomasse um. Pflanzenbiomasse besteht hauptsächlich aus Zellwänden, einem komplexen Netzwerk verschiedener Polymere, das alle Pflanzenzellen umgibt. Hier bestimmen wir die Zusammensetzung der pflanzlichen Zellwandmaterialien, um das Potenzial zur Umwandlung dieser Lignin Cellose X, die eine äußerst reichlich vorhandene nachwachsende Ressource darstellen, in Biokraftstoffe einzuschätzen.

Heute konzentrieren wir uns in einem weiteren Video mit dem Titel „Umfassende Zusammensetzungsanalyse von Pflanzenzellwänden, Teil zwei: Kohlenhydrate“ auf das Polyphenol Lignin. Dabei liegt der Schwerpunkt auf der Polysaccharid-Analyse. Um dieses Verfahren zu beginnen, geben Sie drei 5,5 mm große Edelstahlkugeln in ein 2 ml Schraubkappenröhrchen sowie etwa 60 bis 70 mg luft- oder gefriergetrocknetes Pflanzenmaterial.

Das Material kann mithilfe von Eyewall, einem Mahl- und Dosierroboter, zu einem feinen Pulver zermahlen werden. Eyewall nimmt das Röhrchen und schüttelt es 30 Sekunden lang, wodurch das Material durch die Metallkugeln zu einem feinen Pulver zermahlen wird. Anschließend wird das gemahlene, aber kompakte Pflanzenpulver gelockert – ein alternatives, nicht robotergestütztes Verfahren mit geringer Durchsatzleistung. Die Erleichterung eines Retro wird im zweiten Teil dargestellt: Geben Sie 1,5 M 70%iges wässriges Ethanol zum gemahlenen Material hinzu, wirbeln Sie gründlich um und zentrifugieren Sie bei Raumtemperatur.

Diese Behandlung löst die meisten Proteine und zellulären Organellen auf; pipettieren Sie den Überstand ab und geben Sie ein gleiches Volumen an Chloroform-Methanol-Lösung zum alkoholunlöslichen Pellet hinzu. Gründlich schütteln, um den Pellet erneut aufzuschwemmen, und zentrifugieren. Die Chloroform-Methanol-Lösung extrahiert hydrophobe Verbindungen wie Lipide; nach der Zentrifugation den Überstand abpipettieren und den Pellet in 500 µL Aceton resuspendieren.

Um die Probe zu trocknen, verdampfen Sie das Lösungsmittel mit einem Luftstrom bei 35 Grad Celsius, bis die Probe trocken ist; die getrockneten Proben können bei Raumtemperatur gelagert werden, bis sie weiterverarbeitet werden. Um die Entfernung von Stärke aus der Probe erneut zu starten, suspendieren Sie das Pellet in 1,5 ml 0,1-molarer Natriumacetat-Pufferlösung (pH 5), verschließen Sie die Röhrchen und erhitzen Sie sie in einem Heizblock, um die Stärke zu verkleistern. Nach dem Abkühlen der Suspension auf Eis fügen Sie die stärkeabbauende Enzymmischung hinzu, verschließen Sie das Röhrchen und wirbeln Sie es gründlich durch Vortexen; inkubieren Sie die Suspension über Nacht.

Im Schüttelinkubator bei 37 Grad Celsius sorgt ein Rotationsschüttler für eine ordnungsgemäße Vermischung. Beenden Sie nach der Übernachtsinkubation die Verdauung durch Erhitzen in einem Heizblock bei 100 Grad Celsius für 10 Minuten. Anschließend zentrifugieren und den Überstand verwerfen, der eine solubilisierte Stärke enthält.

Washen Sie das verbleibende Pellet dreimal mit jeweils 1,5 mL Wasser durch Wirbelmischen, Zentrifugieren und Dekantieren, wie zuvor gezeigt. Schließlich resuspendieren Sie das Pellet in 500 µL Aceton und verdampfen das Lösungsmittel mit einem Luftstrom bei 35 °C bis zur Trockne. Die getrockneten Proben, die isolierte Zellwand oder Bein, keine Cellulosen enthalten, sind bereit für weitere Analysen und können bei Raumtemperatur gelagert werden.

Wiegen Sie zunächst ein bis 1,5 Milligramm des vorbereiteten Zellwandmaterials. Das Material kann manuell oder automatisiert mit der Augenwand, wie in Teil zwei gezeigt, gewogen werden. Spülen Sie die Röhrenwände mit 250 Mikrolitern Aceton, um das Zellwandmaterial am Boden der Röhre zu sammeln, und verdunsten Sie das Aceton vorsichtig unter Luftstrom.

Nachdem das Aceton vollständig verdunstet ist, vorsichtig 100 Mikroliter frisch hergestellte 25 %ige (Volumen pro Volumen) Acetylbromid-Lösung in essigsaurer Gletschereis entlang der beiden Wände hinzufügen. Um Spritzen zu vermeiden, wird durch eine schonende Bromidbehandlung das Ligninpolymer in seine acetylierten Monomere abgebaut. Danach den Messkolben verschließen und zwei Stunden lang bei 50 Grad Celsius erhitzen.

Erhitzen Sie eine zusätzliche Stunde lang unter viermaligem Schütteln alle 15 Minuten und kühlen Sie anschließend auf Eis ab. Geben Sie nach Abkühlen des Kolbens bei Raumtemperatur 400 Mikroliter zweimolare Natriumhydroxidlösung und 70 Mikroliter frisch hergestellte 0,5-molare Hydroxylaminhydrochlorid-Lösung hinzu und wirbeln Sie die Messkolben. Neutralisieren Sie danach die Lösung, indem Sie den Messkolben genau bis zur 2-Milliliter-Marke mit Essigsäure (Eisessig) auffüllen, verschließen und mehrmals umdrehen, um gut zu mischen. Pipettieren Sie 200 Mikroliter der Lösung, die die hydrolysierten und solubilisierten Monoaldehyde enthält, in eine UV-transparente 96-Well-Platte und messen Sie die Platte in einem Mikroplatten-Reader bei 280 Nanometern. Messen Sie die Platte mindestens dreimal und bilden Sie den Mittelwert der Extinktion, da Partikel geringfügige Schwankungen der Extinktionswerte verursachen können.

Bestimmen Sie den Prozentsatz eines schwach wasserlöslichen Lignins oder A BSL unter Verwendung des geeigneten Pflanzenkoeffizienten mit der Formel, die im schriftlichen Protokoll dargestellt ist. Lignin ist ein Polyphenol-Netzwerk, das hauptsächlich aus drei Untereinheiten besteht: P-Hydroxyphenol, Gua ACell und Spring-Roll-Einheiten, um die Zusammensetzung des Lignins im Pflanzenmaterial zu bestimmen. Beginnen Sie damit, etwa zwei Milligramm Zellwandmaterial in ein verschließbares Glasröhrchen für die Cytolyse umzusetzen.

Als Nächstes bereiten Sie die 2,5 %ige Borontrifluoridethylat- und 10 %ige Ethanethiol-Lösung in Dioxan vor. Da Dioxan sehr gefährlich ist, entnehmen Sie keine Proben oder Geräte außerhalb des Abzugs. Arbeiten Sie stets sehr sorgfältig und verwenden Sie einen mit Stickstoffgas gefüllten Ballon, um das verlorene Volumen in der Dioxan-Flasche mit Stickstoff zu ersetzen.

Bereiten Sie die Lösung vor, indem Sie pro Probe die folgenden Volumina mischen: 175 µL Dioxan, 20 µL ETSH und fünf µL BF3. Nach dem Mischen geben Sie 200 µL der Lösung zu jeder Probe hinzu. Spülen Sie den Flüssigkeitsraum des Vials mit Stickstoffgas und verschließen Sie es.

Heizen Sie die Proben unverzüglich vier Stunden lang auf 100 Grad Celsius, wobei alle Stunde eine vorsichtige Mischung erfolgt. Beenden Sie die Lysereaktion, indem Sie die Probe fünf Minuten lang auf Eis abkühlen. Geben Sie anschließend 150 Mikroliter einer 0,4-molaren Natriumbikarbonatlösung zu, um zu neutralisieren, und wirbeln Sie die Probe kurz an.

Für die Aufreinigung der Lignin-Abbauprodukte ein Milliliter Wasser und 0,5 Milliliter Acetat hinzufügen, vortexen und die Phasentrennung abwarten. Die Ethylacetatschicht befindet sich oben und das Wasser unten. 150 Mikroliter der oberen Ethylacetatschicht, die die Ligninbestandteile enthält, in ein 2-Milliliter-Gefäß überführen, wobei sichergestellt werden muss, dass kein Wasser mitübertragen wird.

Nach der Übertragung aus der oberen Ethylacetat-Schicht verdampfen Sie das Lösungsmittel unter Verwendung eines Konzentrators mit Luft. Geben Sie 200 Mikroliter Aceton hinzu und verdampfen Sie es. Wiederholen Sie die Behandlung mit Aceton zwei Mal, um überschüssiges Wasser zu entfernen.

Leiten Sie als Nächstes die Ligninbestandteile zu ihren flüchtigen Trimethylsilyl-Derivaten um. Geben Sie 500 µL Ethylacetat, 20 µL Purin und 100 µL N,O-Bis(trimethylsilyl)acetamid zu jedem Röhrchen hinzu. Inkubieren Sie zwei Stunden bei 25 °C.

Am Ende der zwei Stunden überführen Sie 100 Mikroliter der Reaktion in ein GC-MS-Gefäß und geben 100 Mikroliter Aceton hinzu. Analysieren Sie die Proben mittels GC, ausgestattet mit einem Quadrupol-Massenspektrometer oder einem Flammenionisationsdetektor. Für die Säule und Einzelheiten des Laufs ziehen Sie bitte das beigefügte schriftliche Protokoll zurate.

Hier sind einige repräsentative Ergebnisse der Ligninanaylse unter Verwendung von Pappelholz als Pflanzenmaterial. Laut dieser Analyse besteht 22 % des Pappelmaterials aus dem Polyphenol Lignin. Die Zusammensetzung der Ligninbestandteile wurde mittels GC-MS analysiert.

Die Peaks werden anhand relativer Retentionszeiten unter Verwendung eines Tetra-Cyan-Internen Standards oder durch charakteristische Massenspektrum-Signale bei 299 m/z, 269 m/z und 239 m/z für die S- und G-Monomere identifiziert. Die Zusammensetzung der Ligninbestandteile wird quantifiziert, indem die Gesamtpeakfläche auf 100 % gesetzt wird. Die Zusammensetzungsanalyse zeigt, dass diese bestimmte Probe hauptsächlich Siringyl- oder S-Einheiten enthält. Allerdings sind auch Guajacyl- oder G-Einheiten reichlich vorhanden.

Offensichtlich können Menge und Zusammensetzung der monomeren Einheiten je nach Pflanzengewebe und Art variieren. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man den Ligningehalt und die Zusammensetzung von Pflanzenmaterial für die Analyse von Polysacchariden bestimmt. Wechseln Sie zum zweiten Teil.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.