Umfassende Analyse der Zusammensetzung von pflanzlichen Zellwänden (Lignozellulose) Teil II: Kohlenhydrate

Die Bestimmung der Zusammensetzung der Matrixpolysaccharide und des Gehalts an kristalliner Cellulose in pflanzlichen Zellwänden beginnt mit getrocknetem Pflanzenmaterial, das verschiedenen Extraktionen unterzogen wird. Das resultierende Material besteht ausschließlich aus Zellwänden und wird anschließend aufgeteilt, um die Zusammensetzung der Matrixpolysaccharide zu bestimmen. Das Zellwandmaterial wird mit einer schwachen Säure behandelt, um nichtkristalline Polysaccharide, hauptsächlich die Hemicellulosen, in ihre Monosaccharide zu hydrolysieren.

Die Monosaccharide werden anschließend in ihre entsprechenden flüchtigen Aldolacetate umgewandelt, die dann mittels Gaschromatographie gekoppelt mit einem Massenspektrometer analysiert und quantifiziert werden, um die kristalline Cellulose zu bestimmen. Inhaltswände werden mit dem Graph-Reagenz behandelt, einer Säuremischung, die nicht kristalline Wandbestandteile entfernt. Die verbleibende kristalline Cellulose wird in ihr Monomer Glukose abgebaut, das cholemetrisch bestimmt werden kann.

Die Bestimmung des Ligningehalts und der Zusammensetzung wird in einer weiteren Jove-Videoveröffentlichung mit dem Titel „Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls, part One Lignin“ gezeigt. Hallo, ich bin Marcus Pauley, Leiter der Analytik für Zellwände am Great Lakes Bioenergy Research Center hier an der Michigan State University. Ich bin Cliff Foster, Leiter der Analytik für Zellwände.

Heute zeigen wir Ihnen, wie man die Zusammensetzung der Polysaccharide in pflanzlichem Zellwandmaterial bestimmt, das Cellulose in verschiedenen Homo-Cellulosen ist. Hier im Great Lakes Bioenergy Research Center entwickeln wir Technologien, um diese Zucker in Biokraftstoffe umzuwandeln. Um einen optimalen pflanzlichen Rohstoff zu identifizieren, müssen wir zunächst Art und Häufigkeit der in dieser Biomasse vorhandenen Zucker bestimmen.

In einem weiteren Video mit dem Titel Umfassende Zusammensetzungsanalyse von Pflanzenzellwänden, Teil eins Lignin, werden wir uns auf die Polyphenolanalyse konzentrieren. Beginnen wir also. Starten Sie dieses Verfahren, indem Sie Zellwände isolieren.

Zerkleinern Sie etwa 60 bis 70 Milligramm getrocknetes Pflanzenmaterial mit 5,5-Millimeter-Edelstahlkugeln in einem zwei Milliliter fassenden SAR TED-Schraubverschlussröhrchen. Verwenden Sie als Hochdurchsatz-Alternative eine REM-Mühle und einen Zerkleinerungs- und Dosierroboter namens Eyewall, wie in Teil eins beschrieben. Entfernen Sie nach Beendigung des Zerkleinerns die Edelstahlkugeln.

Fahren Sie mit der Isolierung der Zellwände und der Entfernung von Reststärken gemäß Teil eins und der begleitenden schriftlichen Anleitung fort. Wiegen Sie zwei Milligramm DS-Stärke-Zellwandmaterial in ein 2-milliliter-Probengefäß ab. Eine hochdurchsatzfähige Methode zur Durchführung dieser Aufgabe ist der Eyewall-Roboter.

Der Roboter nimmt ein Gefäß mit zerkleinertem Pflanzenmaterial und sticht ein Loch in den Boden des Gefäßes. Das durchstochene Gefäß wird anschließend auf einen VI-Zuführer gesetzt. Ein leeres Gefäß wird auf eine Waage gestellt und unter den VI-Zuführer verschoben; durch Vibration rieselt das Material durch das Loch im beladenen oberen Gefäß in das leere untere Gefäß, bis die gewünschte Materialmenge aufgefangen ist.

Fügen Sie 100 Mikrogramm Acetol als internen Standard hinzu. Spülen Sie die Röhrchenwände mit Aceton, um das Zellwandmaterial am Boden des Röhrchens zu sammeln, und verdampfen Sie das Aceton sehr vorsichtig unter Luftstrom. Führen Sie anschließend eine schwache saure Hydrolyse durch.

Fügen Sie vorsichtig 250 Mikroliter zweimolares Trichloressigsäure oder TFA zu jeder Probe hinzu, wobei sichergestellt werden muss, dass kein Material an die Röhrenwände spritzt. Verschließen Sie die Röhrchen fest und inkubieren Sie sie 90 Minuten lang bei 121 Grad Celsius in einem Heizblock. Kühlen Sie anschließend den Heizblock und die Proben auf Eis ab und zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 10.000 U/min für 10 Minuten.

Überführen Sie 100 Mikroliter des sauren Überstandes, der die gelösten Zuckermoleküle des Matrixpolysaccharids enthält, in Schraubkappenvials, wobei darauf zu achten ist, das Pelletmaterial nicht aufzuwirbeln. Das Pellet kann für den Nachweis kristalliner Cellulose verwendet werden. Verdampfen Sie die TFA in einem Glasröhrchen unter einem sanften Luftstrom in einer Verdampfungsvorrichtung.

Geben Sie 300 Mikroliter 2-Propanol zu, um überschüssige Säure zu entfernen, wirbeln Sie die Probe und verdampfen Sie bei 25 Grad Celsius. Wiederholen Sie den Vorgang insgesamt dreimal. Um die Identifizierung der Monosaccharide mittels Gaschromatographie zu ermöglichen, führen Sie eine Aldol-Acetat-Derivatisierung durch.

Zunächst werden die Monosaccharide zu ihren entsprechenden offenen Ring-Aldolen reduziert, die anschließend acetyliert werden. Weitere Einzelheiten finden Sie im beigefügten schriftlichen Protokoll. Jeder Schritt des Verfahrens folgt dem zuvor beschriebenen Protokoll: Zugabe des Reagenz, Inkubation, Verdampfung unter einem Luftstrom und anschließende Entfernung des überschüssigen Reagenz durch mehrere Waschschritte.

In den letzten Schritten werden die Aldolacetate extrahiert. Geben Sie zunächst 500 Mikroliter Ethylacetat hinzu und schwenken Sie vorsichtig. Fügen Sie dann zwei Milliliter Wasser hinzu, verschließen Sie die Röhrchen und wirbeln Sie sie durch. Zentrifugieren Sie die Röhrchen fünf Minuten bei 2000 U/min, um klare, getrennte Phasen zu erhalten, wobei sich das Ethylacetat oben befindet, das die Aldolacetate enthält, und die wässrige Phase unten. Pipettieren Sie 50 Mikroliter der Ethylacetatschicht in GC-MS-Gläschen mit Einsätzen. Verdünnen Sie, indem Sie 100 Mikroliter Aceton zum GC-Gläschen hinzufügen. Das GC-Gläschen kann bei vier Grad Celsius gelagert werden.

Wenn die GC-MS-Analyse nicht unmittelbar durchgeführt wird, injizieren Sie die Proben in einen Gaschromatographen, der mit einem Quadrupol-Massenspektrometer ausgestattet ist. Für Angaben zur Säule und Einzelheiten des Laufs ziehen Sie bitte das beigefügte schriftliche Protokoll heran. Als Ausgangsmaterial zur Bestimmung des kristallinen Cellulosegehalts kann isoliertes Zellwandmaterial oder bereits mit der schwachen Säure TFA behandeltes Wandmaterial dienen, entweder unmittelbar nach der Säurebehandlung oder in lagerfähiger, getrockneter Form.

Nachdem überschüssiges TFA wie zuvor gezeigt mit Isopropanol entfernt wurde, fügen Sie zum TFA-Pellet in den zwei M Sars ein M der Up-Degra-Reagenz-Lösung hinzu, die aus Essigsäure, Salpetersäure und Wasser besteht, und geben Sie ein Volumenverhältnis von acht zu eins zu zwei hinzu. Verschließen Sie das Röhrchen fest, wirbeln Sie es kräftig und erhitzen Sie es 30 Minuten lang auf einem Heizblock bei 100 Grad Celsius. Als Ergebnis dieser Behandlung verbleibt nur kristalline Cellulose im Pellet.

Alle anderen Polysaccharide werden in kalten Proben im Block auf Eis auf Raumtemperatur oder kühler hydrolysiert. Anschließend die Proben nach der Zentrifugation bei 10.000 U/min 15 Minuten lang zentrifugieren, den Überstand verwerfen und sicherstellen, dass das Pellet nicht gestört wird und kein Material aus dem Pellet entfernt wird. Lassen Sie hierzu etwa 150 Mikroliter des Überstandes im Reaktionsgefäß und waschen Sie das Pellet mehrmals mit Wasser.

Führen Sie anschließend eine säurekatalysierte Hydrolyse mit konzentrierter Schwefelsäure durch, um den Kristall und den Cellulosepellet vollständig in Glukose zu hydrolysieren. Geben Sie zunächst 175 Mikroliter 72%ige Schwefelsäure in das Sartorius-Röhrchen und inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur. Nach der ersten Inkubation wirbeln Sie die Probe und inkubieren weitere 15 Minuten.

Dann 825 µL Wasser hinzufügen und die Proben vortexen und fünf Minuten bei 10.000 U/min zentrifugieren. Möglicherweise befindet sich ein braunes, lösliches Material, hauptsächlich Lignin, im Reaktionsgefäß, während die Glukose im Überstand vorliegt. Der Glukosegehalt des Überstandes wird mittels kolorimetrischer Anthron-Methode bestimmt.

Dieser Test wird in einer 96-Well-Polystyrol-Mikrotiterplatte durchgeführt. Erstellen Sie eine Glucose-Standardkurve in Duplikat, indem Sie den Anweisungen im beigefügten schriftlichen Protokoll folgen. Bereiten Sie die Proben vor, indem Sie jeweils 10 Mikroliter jeder Probe, Überstand und 90 Mikroliter Wasser in separate Vertiefungen derselben Mikrotiterplatte geben, und vervollständigen Sie den Vorgang durch Zugabe von 200 Mikrolitern frisch zubereiteter und verworfener Reagenz.

Als Nächstes die Platte 30 Minuten lang bei 80 Grad Celsius in einem Ofen mit einer Aluminium-Wärmeverteilplatte erhitzen. Beobachten Sie, dass die Proben mit Glukose nach Beendigung des Erhitzens von gelb nach blaugrün wechseln. Die Platte auf Raumtemperatur abkühlen lassen und gründlich schütteln.

Lesen Sie die Absorption bei 625 Nanometern mit einem Mikrotiterplatten-Reader ab. Der Gehalt an Glukose, dem Baustein von Cellulose, wird anhand der Extinktion im Vergleich zur auf derselben Platte erstellten Standardkurve berechnet. Hier sind einige repräsentative Ergebnisse der Polysaccharid-Analyse eines Pappelholzstücks.

Die Peaks des Gaschromatogramms werden anhand von Massenprofilen und/oder Retentionszeiten von Standards identifiziert. Die Monosaccharide werden basierend auf Kalibrierkurven quantifiziert. Die Zuckeranalyse der Matrixpolysaccharide zeigt einen hohen Gehalt an Xylose, die Hemicellulose-Xylan repräsentiert, aber auch andere Zucker sind vorhanden.

Laut der Analyse besteht 40 % des Pappelmaterials aus Kristallen und Cellulose. Bitte beachten Sie, dass diese Gehalte und Zusammensetzungen von Pflanze zu Pflanze oder zwischen verschiedenen Pflanzenanatomien variieren können. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man den Polysaccharidgehalt und die Zusammensetzungsanalyse von lignocellulosischer Biomasse für die Analyse von Polyphenollignin bestimmt.

Sehen Sie sich Teil eins an. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.