Die Entzifferung Axonal Pathways von genetisch definierte Gruppen von Neuronen in der Küken Neuralrohr Verwendung In ovo Elektroporation

Hallo, ich bin Ham aus dem Labor von Dr. Review Klar an der Abteilung für medizinische Neurobiologie der Hebräischen Universität von Jerusalem. Hallo, ich bin Sophie Esman und komme ebenfalls aus einem Lars-Labor. Heute werden wir Ihnen ein Verfahren für Innovo, Elektroporation und die Vorbereitung des offenen Rückenmarks zeigen.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die axonalen Verläufe genetisch definierter neuronaler Populationen im embryonalen Rückenmark zu untersuchen. Beginnen wir also. Überführen Sie befruchtete Eier von weißen Leghorn-Hühnern zur Initiierung dieses Verfahrens von Raumtemperatur in einen befeuchteten Inkubator, vorzugsweise mit schaukelnden Einschüben, bei 37 bis 38 Grad Celsius.

Es ist wichtig, die Temperatur und Luftfeuchtigkeit des Inkubators zu überwachen, um lebensfähige und synchronisierte Embryonen zu erhalten. Die Hühnerembryonen werden elektroporiert, sobald sie den Hamburger-und-Hamilton- oder HH-Stadium 18 bis 20 erreicht haben, welches ein optimales Stadium für die expressionsabhängige Aktivität von Enhancern darstellt. Zu diesem Zeitpunkt liegt der Kopf im rechten Winkel zum Rumpf.

Auch im HH-Stadium 18 bis 20 sollten umfangreiche extraembryonale Blutgefäße wie die vorderen, hinteren rechten und linken Vitellinliniengefäße sichtbar sein. Die Hühnerembryonen erreichen das HH-Stadium 19 bis 20 nach 66-stündiger Inkubation; zu diesem Zeitpunkt die Eier aus dem Inkubator nehmen. Nach dem Entfernen der Eier diese horizontal lagern und fünf bis zehn Minuten warten. Das Embryo befindet sich nun am oberen Pol des Eis.

Vor der Elektroporation bereiten die Embryonen Hank’s Lösung mit 100 Einheiten pro Milliliter Penicillin und 0,1 Milligramm pro Milliliter Streptomycin vor. Bereiten Sie eine gewünschte DNA-Mischung mit zwei bis fünf Mikrogramm pro Mikroliter vor und geben Sie ein paar Körner des Fast-Green-Farbstoffs hinzu, um die injizierte DNA leicht sichtbar zu machen. Halten Sie eine Mundpipette, eine sterile Spritzennadel, kleine Schere und ein Klebeband bereit.

Bereiten Sie Mikrokappillaren vor, indem Sie Glas-Kapillaren mit einem Durchmesser von 0,5 Millimeter mit einem Pipettenzuggerät ziehen. Setzen Sie die Wolframelektroden in die Mikromanipulatoren ein und verbinden Sie die Elektroden mit dem Impulsgenerator. Stellen Sie die Spannung am Impulsgenerator auf minus 30 Volt, die Dauer jedes Impulses auf 50 Millisekunden und die Anzahl der Impulse auf drei.

Fahren Sie mit der Elektroporation fort, bevor die Embryonen exponiert und handhaben werden. Setzen Sie eine Spritze an dem schmalen Pol des Eis an und entnehmen Sie fünf bis sechs Milliliter Albumin aus jedem Ei. Das Albumin wird entfernt, um ein Verschütten zu vermeiden.

Beim Schneiden im nächsten Schritt die kleinen Scheren zum Schneiden verwenden. Nach dem Freilegen des Hühnerembryos an der Oberseite des Eis ein ovales Fenster öffnen und dieses mit 0,5 bis einem Milliliter Hank’s- und Penicillin-Streptomycin-Lösung befeuchten. Danach mit einer Mundpipette die Glas-Mikrokappe füllen.

Mit einer DNA-Färbelösung sollte eine Mikrokapi­llare mit dem richtigen Durchmesser problemlos mit DNA befüllbar sein. Positionieren Sie unter dem Binokular das Embryo so, dass die DNA in den Neuralrohrabschnitt injiziert werden kann. Stellen Sie das Embryo mit dem Schwanzende zu sich hin.

In diesem Entwicklungsstadium ist das Rückenmark deutlich sichtbar, sodass keine Kontrastierungsverfahren erforderlich sind. Das Rückenmark ist an beiden Enden, am Kopf- und am Schwanzende, verschlossen. Bei mikrokapillaren Einstichen sollten jedoch mehrere Löcher in den Neuralrohr hinein und unter flachem Winkel erfolgen; eine Mikrokapillare, die dünn genug und von korrektem Durchmesser ist, sollte das Rohr durchdringen, ohne es zu beschädigen.

Injizieren Sie die DNA mithilfe einer Mundpipette. Eine Mikrokappe mit dem richtigen Durchmesser sollte die DNA bei gleichmäßigem Ausatmen freisetzen. Der grüne Farbstoff sollte sich von der Schwanzspitze bis zu den Vesikeln des sich entwickelnden Gehirns ausbreiten.

Spritzen Sie ein, bis der Neuralrohr mit DNA gefüllt ist. Die Elektroporation ist erforderlich, damit die injizierte DNA in die Zellen eindringen kann. Zuerst platzieren Sie die Elektroden parallel zum Neuralrohr und so nah wie möglich daran, ohne das Rohr selbst zu berühren. Stellen Sie sicher, dass die Elektroden mit Flüssigkeit bedeckt sind, um die elektrische Leitfähigkeit während des Impulses zu gewährleisten.

Normalerweise genügt die Hank-Lösung, die unmittelbar nach der Exposition des Embryos hinzugefügt wird. Falls dies nicht der Fall ist, geben Sie einen Tropfen Hank-Lösung hinzu, kurz bevor der Puls erfolgt, wobei die Elektroden positioniert und in der Flüssigkeit untergetaucht sind, um den Elektropuls durchzuführen. Entfernen Sie danach vorsichtig die Elektroden und verschließen Sie das Fenster sowie das Ei mit Klebeband. Es ist wichtig, das Ei vollständig abzudichten, um ein Austrocknen des Embryos während der anschließenden Inkubationsphase zu verhindern.

Legen Sie das Ei zurück in den Inkubator und inkubieren Sie es, bis das Hühnerembryo den embryonalen Entwicklungstag sechs oder E sechs erreicht hat, zu dem Zeitpunkt, zu dem die Bildgebung erfolgen soll. Wenn das elektroporierte Embryo den embryonalen Entwicklungstag sechs, E sechs, drei Tage nach der Elektroporation erreicht hat, nehmen Sie es aus dem Ei heraus und legen Sie es mit feinen Scheren in eine mit Silikon beschichtete Petrischale, die PBS enthält.

Schneiden Sie die Membranen ab und spannen Sie das Embryo auf der Bauchseite mithilfe von Nadeln, die in die Silikonmasse gesteckt werden, um es zu fixieren. Verwenden Sie eine scharfe Wolfram-Mikrokapi­llare, um einen longitudinalen Schnitt entlang der Dachplatte vom Nachhirn bis zum Schwanzansatz durchzuführen.

Erstellen Sie zwei zusätzliche längs verlaufende Inzisionen auf beiden Seiten des Rückenmarks, um die dorsalen Wurzelganglien oder DRGs vom Rückenmark zu lösen. Lösen Sie die Bodenplatte vom Gewebe ausgehend vom Schwanz bis zum Hinterhirn, wobei das Rückenmark intakt bleibt. Schließlich schneiden Sie mit feiner Schere das Rückenmark im Querschnitt am Hinterhirn durch und trennen Sie das Rückenmark vom Körper ab.

Nachdem nun das Rückenmark isoliert wurde, breiten Sie es in einer neuen, silikonbeschichteten Petrischale, die PBS enthält, unter Verwendung von Nadeln aus, wobei das Rückenmark vom Hinterhirn bis zum Schwanz fixiert wird, um eine flache Präparation herzustellen. Fixieren Sie das Rückenmark eine Stunde lang bei Raumtemperatur in 4 % Paraldehyd in PBS, gefolgt von der Immunfärbung gemäß dem detaillierten und beigefügten schriftlichen Protokoll zur offenen Montage des Rückenmarks. Buchpräparation zur Bildgebung.

Verteilen Sie Vaseline oder Silikon in rechteckiger Form auf einem Objektträger und geben Sie PBS-Tropfen innerhalb des Rechtecks hinzu. Platzieren Sie mit einer Pinzette das Rückenmark in der Mitte des Rechtecks, strecken Sie es und entfernen Sie die umgebende Flüssigkeit. Geben Sie mit einer feinen Pipette ein bis zwei Tropfen Einbettmedium auf das Rückenmark und decken Sie es mit einem Deckglas ab.

Üben Sie Druck auf die Deckglas aus, um Luftblasen zu vermeiden. Bewahren Sie die Objektträger im Dunkeln bei vier Grad Celsius auf.

Untersuchen Sie das Rückenmark mithilfe der konfokalen Mikroskopie. Hier sind einige repräsentative Ergebnisse zur axonalen Abstoßung von Interneuronen des Hühner-Rückenmarks in Kontrollexperimenten, bei denen RFP in allen Neuronen unter Verwendung eines ubiquitären Enhancerelements aus CMV exprimiert wird. Die meisten Neuronen und ihre Axone sind markiert. Es ist unmöglich, die axonalen Verläufe neuronaler Subpopulationen zu entschlüsseln.

Jedoch wird bei Anwendung spezifischer Enhancerelemente ein definierter axonaler Verlauf einer spezifischen Teilpopulation von DI-Neuronen in diesem Beispiel sichtbar. Wir haben Ihnen also gerade gezeigt, wie man bei E drei einen Kiefer-Neuralrohrabschnitt mit einem spezifischen neuronalen Enhancer elektroporiert und wie man bei E sechs ein offenes Buch-Rückenmark präpariert. Wenn Sie dieses Verfahren durchführen, sollten Sie stets vorsichtig und geduldig sein.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten. Viel Erfolg.