Analysieren Antworten der Maus Riechzellen Mit der Air-Phase Electroolfactogram Recording

Eine Präparation des Riechepithels wird auf eine Schale montiert und in einen Strom feuchter Luft gebracht. Unter einem Stereomikroskop wird eine Referenzelektrode über eine Pufferlösung elektrisch mit dem Gewebe verbunden. Eine Ableitelektrode wird auf die Oberfläche des Riechepithels platziert.

Das Riechepithel wird durch computergesteuerte Duftstoffstöße stimuliert, die in einen Strom feuchter Luft eingebracht werden und so die Duftstoffe zum Riechepithel transportieren. EOG-Signale werden über einen Verstärker und Digitalisierer an den Aufnahmecomputer übertragen. Hallo, ich bin Catherine Ciar vom Hygienelabor XO am Fachbereich Biologie der Johns Hopkins University.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Ableitung des Elektroolfaktogramms von Mäusen. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Reaktionen olfaktorischer Sinnesneuronen auf Gerüche zu untersuchen. Beginnen wir also.

Die Aufzeichnungsvorrichtung besteht aus einer Ableiteelektrode, einer Referenzelektrode, einer Luftzuführungsröhre, einer Probenträgerplatte und einem Auflichtmikroskop, die alle auf einem Lufttisch innerhalb einer Faradayschen Käfiganordnung befestigt sind. Mikromanipulatoren dienen der Positionierung der Elektroden in der Luftzuführungsröhre. Ein kontinuierlicher Luftstrom wird zur Befeuchtung durch destilliertes Wasser geleitet, bevor er durch die Luftzuführungsröhre und über die Probe strömt.

Eine 60 Millimeter große Kulturschale, gefüllt mit Sard, angepasst auf sechs bis acht Millimeter, dient als Montageoberfläche für die Probe. In die Sard in der Montageschale werden eine Vertiefung und ein Kanal ausgehöhlt. Dies dient dazu, über eine modifizierte Ringer-Lösung eine elektrische Verbindung zwischen der Referenzelektrode und der Probe herzustellen.

Die Ableit- und Referenzelektroden werden mit einem Verstärker verbunden. Signale vom Verstärker werden an einen Digitalisierer und anschließend an einen Computer gesendet. Die Software XI graph dient zur Steuerung des Stimulationsprotokolls, zur Aufzeichnung des Signals und zur Analyse der Antworten.

Ein Oszilloskop ist nach dem Verstärker angeschlossen, um die elektrische Potentialänderung in Echtzeit während des Einbringens der Ableitelektrode und während der EOG-Ableitungen zu überwachen. Die Applikation der Duftstoffreize wird über einen Pico-Spritzer gesteuert, der mit demselben Computer verbunden ist, der auch für die Signalerfassung genutzt wird, unmittelbar vor der Applikation eines Duftstoffreizes.

Die Ausgabe des Pico-Spritzers ist mit einer Duftstoffflasche verbunden, die flüssigen Duftstoff enthält. Die Flasche ist anschließend mit dem Luftzufuhrschlauch verbunden. Nun sehen wir uns an, wie man Elektroden für Ableitungsexperimente vorbereitet.

Die Ableitelektrode ist ein versilberter Chlorid-Draht in einer gezogenen Glas-Kapillare, die mit modifizierter Ringer-Lösung gefüllt ist. Die Referenzelektrode ist ein versilberter Chlorid-Draht. Beginnen Sie die Vorbereitung beider Elektroden, indem Sie einen Silberdraht in den Elektrodenhalter einsetzen.

Für die Ableitelektrode sollten ein bis zwei Zentimeter Draht aus dem Ende des Elektrodenhalters herausragen. Für die Bezugselektrode kann mehr Draht belassen werden. Um die Silberchlorid-Beschichtung aufzubringen, positionieren Sie den Draht in 0,1-molarer Natriumchloridlösung und verbinden Sie den Elektrodenhalter mit dem positiven Pol einer Gleichstromquelle mit 1,5 bis 9 Volt.

Der Minuspol der Stromquelle sollte elektrisch mit der 0,1-molaren Natriumchloridlösung verbunden werden. Lassen Sie die Chloridreaktion 10 Minuten lang ablaufen, um jegliche statische Ladung zwischen der Ableitelektrode und der Referenzelektrode auszugleichen. Berühren Sie die Elektroden kurzzeitig gegeneinander, bevor Sie sie am Ableitgerät anbringen.

Ziehen Sie anschließend eine Glas-Kapillare mit einem Mikropipettenzuggerät. Die Öffnung an der Spitze der Kapillare sollte einen Durchmesser von etwa fünf bis 10 Mikrometern aufweisen. Verwenden Sie einen Diamantschreiber, um die stumpfe Endseite der Kapillare einzuritzen und abzubrechen, sodass sie etwa zwei Zentimeter länger als der Silberdraht ist.

Verwenden Sie eine Butanflamme, um das geschnittene Ende zu glühen, und schmelzen Sie nun 0,5 % Agaros in modifizierter Ringer-Lösung. Ziehen Sie mit einer Übertragungspipette eine kleine Menge der geschmolzenen Agaros-Lösung in die Spitze der Elektrode, wobei Sie eine Spritze verwenden, die erhitzt und so gezogen wurde, dass sie ein langes, dünnes Ende aufweist. Füllen Sie die gezogene Kapillare etwa zur Hälfte.

Mit der modifizierten Ringer-Lösung vorsichtig an der Kapillare klopfen, um eventuelle Luftblasen zu lösen. Die gefüllte Elektrode in dem Aufbewahrungsgefäß mit einer kleinen Menge modifizierter Ringer-Lösung am Boden aufbewahren, bis sie verwendet wird. Sobald eine Gewebeprobe vorbereitet und zur Ableitung bereit ist, eine gefüllte Kapillare über den Ableitungselektrodendraht setzen, wobei die Elektroden bereitstehen müssen.

Wir betrachten nun ein Aufnahmeexperiment, um das Gewebe für die Ableitung vorzubereiten. Entfernen Sie die Haut über dem Schädel einer getöteten Maus und halbieren Sie den Kopf entlang der Mittellinie. Befestigen Sie eine Kopfhälfte mit der medialen Seite nach oben in der Montageschale. Entfernen Sie vorsichtig das Septum, um die Conchae zu exponieren.

Platzieren Sie die Schale mit dem befestigten Gewebe auf dem Aufnahmetisch. Richten Sie den Tisch so aus, dass die Ableitungsstelle an den Conchae unter dem Mikroskop zentriert ist. Schalten Sie nun den Lufttank ein, um befeuchtete Luft mit etwa 600 Milliliter pro Minute an die Conchasoberfläche abzugeben.

Platzieren Sie das Luftzufuhrrohr so, dass es sich etwa 10 Millimeter vom Aufzeichnungsort entfernt befindet. Stellen Sie den Verstärker auf DC-Modus ein, da eine AC-Verstärkung Artefakte im EOG-Signal verursachen würde. Nehmen Sie die Signale mit einem Tiefpassfilter von einem Kilohertz und einer Verstärkung von 100 x auf.

Befestigen Sie nun die Ableit- und Referenzelektrode an den Mikromanipulatoren. Senken Sie die Referenzelektrode in die Vertiefung der Montageschale und bedecken Sie sie mit modifizierter Ringer-Lösung, sodass eine elektrische Verbindung zum Gewebe besteht. Senken Sie die Ableitelektrode vorsichtig auf die Oberfläche der Concha bullosa B oder Concha media drei ab.

Die Elektrode sollte die Oberfläche des Riechepithels gerade berühren. Wenn die Elektrode mit dem Epithel in Kontakt kommt, erscheint eine gerade Linie als Basislinie auf dem Oszilloskop. Befestigen Sie nun eine Duftstoffflasche an dem Seitenanschluss des Luftzufuhrrohrs am Computer.

Starten Sie ein Stimulationsprotokoll. Die Abtastrate für die Datenerfassung sollte zwei Kilohertz oder höher betragen. Die Software wird einen Duftpuls auslösen und mit der Aufzeichnung beginnen.

Ein typisches Stimulationsprotokoll kann eine Dauer von 100 Millisekunden umfassen, bestehend aus einem einzelnen gepaarten Puls mit 100 Millisekunden langen Impulsen, die durch ein Intervall von einer Sekunde getrennt sind, oder einem zehnsekündigen dauerhaften Puls. Um die Adaptation zu minimieren, sollte zwischen den Protokollen nach Applikation hoher Duftstoffkonzentrationen eine Pause von einer bis fünf Minuten eingelegt werden. Eventuell verbleibender Duftstoff in der Röhre kann durch Spülen der Luftleitung mit 95 % Ethanol entfernt werden; danach die Leitung trocknen, bevor mit weiteren Gewebeproben fortgefahren wird.

Die Axo-Graft-Software bietet Werkzeuge zur Messung wichtiger Parameter des EOG-Signals. Solche Parameter umfassen die Antwortamplitude, Latenz, Zeit bis zum Peak sowie Zeitkonstanten der Abschaltung. Mehrere Parameter des EOG sind besonders nützlich für den Vergleich normalisierter Antworten zwischen Mäusen, darunter die Antwortamplitude, die Latenzanstiegszeit, die Zeit bis zum Peak und die Zeitkonstante der Abschaltung.

Hier gezeigt sind OGs einer Maus als Reaktion auf die Stimulation mit zunehmenden Konzentrationen von flüssigem Amylacetat. Die schwarze Linie oben zeigt den Zeitpunkt und die Dauer der Duftstoffstimulation an. Hier sehen wir eine Dosis-Wirkungs-Beziehung, gemittelt über fünf Mäuse; die Fehlerbalken entsprechen 95-%-Konfidenzintervallen.

Ein Rückgang der Spitzenamplitude wird häufig bei sehr hohen Duftstoffkonzentrationen beobachtet. Ein Beispiel eines EOG als Antwort auf eine gepaarte Pulssimulation zeigt, dass ein einzelner kurzer Duftstoffpuls eine Anpassung auslöst, die mehrere Sekunden andauert. Dargestellt ist hier ein EOG als Antwort auf 10 Sekunden anhaltende Duftstoffstimulation.

Die EOG zeigt eine Desensibilisierung während kontinuierlicher Duftstoffpräsentation. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man das Elektrodenfaktorgramm von Mäusen aufzeichnet. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Elektrode lediglich auf der Oberfläche des Epithels zu platzieren und sie nicht unter die Oberfläche einzuführen.

Notieren Sie immer von derselben Seite des Kopfes und vermeiden Sie Änderungen am Aufbau, um Variationen zu minimieren. Halten Sie das Gewebe feucht, aber vermeiden Sie die Ansammlung von Flüssigkeitstropfen. Wenn Sie das Gewebe unmittelbar nach der Dissektion unter befeuchtete Luft legen, bleibt es in optimalem Zustand für die Ableitung. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.