Imaging Gerüche hervorgerufene Aktivitäten in der Maus Riechhirn mit Optical Reflexions-und Autofluoreszenzsignale
31. Oktober 2011
Dieser Artikel stellt die Protokolle der intrinsischen optischen Signalen und Flavoproteinen Autofluoreszenzsignale Bildgebung zur Karte Gerüche hervorgerufene Aktivitäten auf der Oberfläche der Riechkolben bei Mäusen.
Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die geruchsbedingten Aktivitäten an der Oberfläche des Riechkolbens von Mäusen mittels intrinsischer optischer Signale und Flavoprotein-Autofluoreszenz-Signalen oder FAS-Bildgebung zu kartieren, nachdem die Maus anästhesiert und der Schädel freigelegt wurde. Der Knochen über dem Riechkolben wird abgeschliffen. Mithilfe der Spitze einer Skalpellklinge wird eine Knochenklappe angelegt und anschließend entfernt. Danach wird eine Kammer aus Zahnzement hergestellt, die die freigelegte Oberfläche des Riechkolbens umgibt.
Es wird mit Aros gefüllt, und ein Deckglas wird auf diese Präparation gelegt. Riechkarten werden nacheinander am selben Mausmodell mithilfe intrinsischer optischer Signale und FAS-Bildgebung erfasst. Die Abbildung anderer evozierter Aktivitäten in der Riechrinde der Maus unter Verwendung von optischer Reflektanz und autofluoreszierenden Signalen kann helfen, zentrale Fragen zur räumlichen Anordnung von Aktivitätsmustern in der Riechrinde zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der 2-Desoxyglukose-Bildgebung oder der fMRT besteht darin, dass es möglich ist, evozierte Aktivitätsmuster mit einer räumlichen Auflösung einzelner Glomeruli aufzuzeichnen.
Im Allgemeinen haben Personen, die neu in diesen Methoden sind, zu Beginn ihrer Arbeit Schwierigkeiten, da sowohl chirurgische als auch instrumentelle Fähigkeiten nur langsam erworben werden. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, um die Aufmerksamkeit auf die kritischen Schritte der chirurgischen und bildgebenden Verfahren zu lenken. Drücken Sie die Hinterpfote der Maus, um die Anästhesie zu überprüfen, und entfernen Sie die Haare von der Kopfhaut mithilfe eines Haarschneidegeräts.
Wischen Sie mit sterilen Mullkompressen, die in destilliertem Wasser getränkt sind, alle verbleibenden Haare von der Haut ab. Platzieren Sie die Maus im stereotaktischen Rahmen, sodass die Schnauze in derselben Ebene wie der Hinterkopf liegt. Um den Riechkolben horizontal auszurichten, befestigen Sie die Ohr- und Nasenhalterungen fest, um Bewegungen zu verhindern.
Tragen Sie Augensalbe auf die Augen auf, um das Austrocknen während der Bildgebung zu verhindern, und desinfizieren Sie anschließend den Bereich der Kopfhaut mit Betadine unter Verwendung steriler Scheren. Führen Sie einen Schnitt am Hinterkopf zwischen den Ohren durch, schneiden Sie dann beidseits entlang der Ohransätze und in anterioposteriorer Richtung entlang der Augenlider in Richtung Stirn. Beenden Sie das Entfernen der Kopfhaut, indem Sie die Haut am Schnauzenbereich durchtrennen.
Unter Verwendung der Nasenstange als Orientierungshilfe. Positionieren Sie das Tier unter einem Stereomikroskop und lösen Sie mit einem mit Kochsalzlösung getränkten Wattestäbchen vorsichtig das Periost von der Schädeloberseite. Entfernen Sie das verbleibende Gewebe mit einer Pinzette und kratzen Sie die Schädeloberfläche mit einem Skalpell ab, um eine saubere Präparation zu gewährleisten und den Bereich des Riechkolbens während des gesamten Experiments feucht zu halten.
Legen Sie ein Stück resorbierbaren Gelatineschwamm, der mit destilliertem Wasser getränkt ist, auf den Knochen über der zwischen den Augen liegenden Riechbülbe. Entfernen Sie den Gelatineschwamm und beginnen Sie vorsichtig, den Knochen mit einer Skalpellklinge Größe 10 abzukratzen. Halten Sie dabei einen konstanten Winkel von 45 Grad zwischen Klinge und Knochen und bewegen Sie die Klinge von den Augenlidern zur sagittalen Seite des Bulbenbereichs.
Dabei vorsichtig sein, keinen vertikalen Druck auf den Knochen auszuüben oder den Knochen oberhalb des Venensinus während des Ausdünnens zu verkratzen. Alle fünf Minuten eine angefeuchtete Gelatineschwamm auf den Knochen legen, um die Präparation abzukühlen. Den Schädel mit dem Schwamm abtupfen, um Knochenpartikel und Staub zu entfernen, und die Klinge des Skalpells regelmäßig abwischen, um sie sauber und scharf zu halten.
Fortsetzen, bis die schwammige Knochenlage oder Trabekel sichtbar ist. Wenn die feine Gefäßversorgung des Riechkolbens sichtbar ist, das Kratzen am Knochen stoppen und die Spitze eines Skalpells Nr. 11 verwenden, um einen rechteckigen Bereich zu zeichnen, der den Riechkolben umschließt. Innerhalb der Grenzen der venösen Sinus weiterhin den Knochen im rechteckigen Bereich abkratzen.
Seien Sie besonders vorsichtig mit der Tiefe der Skalpelspitze, um die Duraoberfläche nicht zu berühren. Um ein Gefühl für die Dicke des verbleibenden Knochens zu erhalten, drücken Sie vorsichtig mit der Spitze eines Pinzettenpaares darauf. Wenn sich der Knochen unter Druck verformt, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.
Ein Tropfen Salzlösung hinzufügen und die horizontale Spitze des Skalpells verwenden, um die Knochenplatte anzuheben. Die Platte vorsichtig mit einer Pinzette entfernen, um ein Abreißen des verbleibenden Knochens zu vermeiden. Sobald die Oberfläche des Riechkolbens freigelegt ist, auf das Fehlen von Blutungen oder Blutgefäßen prüfen. Anastomose.
Wischen Sie die Stelle mit einem in Kochsalzlösung getränkten Gelatineschwamm ab. Um den Riechkolben feucht zu halten, tragen Sie mittels einer 29-Gauge-Spritze polyacrylatbasierten Zahnzement auf, um einen Wall auf dem Knochen um das Schädel-Fenster herum zu bilden. Geben Sie einen Tropfen niedrigschmelzenden Aros über die Dura und platzieren Sie ein steriles Deckglas über das Schädel-Fenster zur Bildgebung.
Platzieren Sie den stereotaktischen Halter unter dem Stereomikroskop, wobei das Schädel-Fenster mittig im Sichtfeld fokussiert wird, um die Kapillaren sichtbar zu machen. Wechseln Sie zu grünem Licht mit 580 Nanometer und nehmen Sie ein anatomisches Kontrollbild auf, um den Zustand der Präparation während der Bildaufnahme zu überprüfen. Fahren Sie anschließend mit der Aufnahme der Stimulationsdurchläufe fort, entweder mittels intrinsischer optischer Signalbildgebung unter 630 Nanometer-Beleuchtung oder mittels Flavoprotein-Autofluoreszenz-Bildgebung unter 480 Nanometer-Beleuchtung. Eine Standard-Bildgebungssitzung umfasst eine Basislinie von fünf bis 10 Sekunden, während der lediglich Luft zugeführt wird, gefolgt von der Duftstimulation für drei bis 10 Sekunden, abhängig von der gewählten Duftkonzentration.
Und schließlich werden 70 bis 82 Sekunden Luftzufuhr zur Aufzeichnung der Baseline-Erholung registriert. Hier wird die Gefäßversorgung des Riechkolbens durch das Schädel-Fenster abgebildet, gefolgt von den Ergebnissen einer Stimulationsserie unter Verwendung von h sinal als Duftstoff, die mittels iOS- und FAS-Bildgebung erfasst wurden. Bei der iOS-Bildgebung zeigt sich die geruchsinduzierte Aktivität als dunkle Absorptionsbereiche; die durch AL aktivierte Bereiche sind durch weiße Pfeile gekennzeichnet, und aktive Bereiche sind sowohl in Einzel- als auch in gemittelten Mehrfachversuchen sichtbar.
Beim Wechsel zur FAS-Bildgebung wird die im selben Maus-OD hervorgerufene Aktivität nun als weiße Bereiche der Autofluoreszenzemission angezeigt, die durch die schwarzen Pfeile markiert sind, und ist ebenfalls in Einzel- sowie in mehrfach gemittelten Aufnahmen sichtbar. Beachten Sie, dass sich sowohl die schwarzen Absorptionszonen, die mittels iOS-Bildgebung sichtbar werden, als auch die weißen Bereiche der Autofluoreszenzemission, die mittels FAS-Bildgebung sichtbar sind, überlappen. Diese räumliche Übereinstimmung bestätigt, dass beide Techniken die Visualisierung derselben olfaktorischen Glomeruli ermöglichen. Nach der Master-Bildreihenfolge können hervorgerufene Aktivitäten mittels optischer Reflexion und Autofluoreszenzsignalen innerhalb einer Stunde für die Chirurgie und einiger Stunden für die Bildaufnahme durchgeführt werden.
Die Hauptnachteile der Verwendung dieser optischen Bildgebungsverfahren bestehen darin, dass sie nicht dazu genutzt werden können, Geruchskarten bei frei beweglichen Mäusen darzustellen. Und aufgrund der begrenzten Eindringtiefe von Photonen in biologisches Gewebe lassen sie nach der Entwicklung Ende der neunziger Jahre, bei der Aufzeichnung intrinsischer Signale im Geruchssystem, keinen Zugang zu den ventralen olfaktorischen Glomeruli. Vielleicht ein Weg für Forscher auf dem Gebiet der optischen Bildgebung, die Eigenschaften der speziellen Beschichtung von Gerüchen zu erforschen.
In der Riechkolben-Flavoprotein-Autofluoreszenzbildgebung ist eine aussichtsreiche Technik, um neue Einblicke in die räumliche Abbildung der Riechknospen unter Verwendung endogener optischer Signale zu erhalten.
Übersicht
In diesem Artikel werden Protokolle zur Abbildung intrinsischer optischer Signale und Flavoprotein-Autofluoreszenzsignale vorgestellt, um geruchsevokierte Aktivitäten an der Oberfläche des Riechkolbens bei Mäusen abzubilden. Die beschriebenen Methoden ermöglichen eine hochauflösende Bildgebung der Aktivität des Riechkolbens und liefern Einblicke in die neuronalen Mechanismen des Geruchssinns.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Geruchsverarbeitung
- Bildgebende Verfahren
Hintergrund
- Das Verständnis der olfaktorischen Verarbeitung ist entscheidend für Erkenntnisse zur sensorischen Wahrnehmung.
- Bildgebende Verfahren wie die intrinsische optische Signalabbildung und die Flavoprotein-Autofluoreszenz sind wertvoll zur Untersuchung der Gehirnaktivität.
- Die Abbildung geruchsevokierter Aktivitäten kann die räumliche Organisation sensorischer Antworten aufzeigen.
- Bestehende Methoden weisen möglicherweise nicht die für eine detaillierte Analyse erforderliche Auflösung auf.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Protokolls zur Abbildung geruchsevokierter Aktivitäten in der Riechbülbe.
- Nutzung intrinsischer optischer Signale und Flavoprotein-Autofluoreszenz für die hochauflösende Bildgebung.
- Aufzeigen der Vorteile dieser bildgebenden Verfahren im Vergleich zu traditionellen Methoden.
Verwendete Methoden
- Mäuse werden anästhesiert und zur Bildgebung vorbereitet, indem das Riechbullen freigelegt wird.
- Der Knochen über dem Riechbullen wird abgeschliffen, um die Bildgebung zu ermöglichen.
- Bei der sequenziellen Bildgebung werden die Reaktionen auf olfaktorische Stimulation mittels intrinsischer optischer Signale und Flavoprotein-Autofluoreszenz erfasst.
- Die Bildgebungssitzungen umfassen Baseline- und Olfaktorisch-Stimulationsphasen, um die hervorgerufenen Aktivitäten zu bewerten.
Hauptergebnisse
- Geruchsevokierte Aktivitäten werden als Bereiche der Absorption und Autofluoreszenz sichtbar gemacht.
- Die Ergebnisse zeigen unterschiedliche Aktivierungsmuster als Reaktion auf verschiedene Gerüche.
- Beide Abbildungstechniken liefern komplementäre Informationen über die Aktivität des Riechkolbens.
- Eine hohe räumliche Auflösung ermöglicht eine detaillierte Kartierung der sensorischen Antworten.
Schlussfolgerungen
- Die entwickelten Protokolle ermöglichen eine effektive Abbildung der Aktivität des Riechkolbens.
- Innere optische Signale und Flavoprotein-Autofluoreszenz sind leistungsfähige Werkzeuge für die Neurowissenschaftsforschung.
- Diese Methoden können unser Verständnis der sensorischen Informationsverarbeitung im Gehirn vertiefen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Abbildung der geruchsevokierten neuronalen Aktivität in der Riechrinde unterstützt die Zielvalidierung in der neurowissenschaftlichen Arzneimittelforschung, indem funktionelle neuronale Schaltkreise, die an der sensorischen Verarbeitung beteiligt sind, sichtbar gemacht werden. Dieser Ansatz trägt zur mechanistischen Risikominderung bei Wirkstoffen bei, die auf olfaktorische Bahnen oder verwandte neurologische Erkrankungen abzielen, indem molekulare Interventionen mit messbaren Veränderungen in den Aktivierungsmustern von Neuronen verknüpft werden. Die Methode erhöht die Vorhersagesicherheit in der frühen Entdeckungsphase, indem sie ein krankheitsrelevantes System bereitstellt, um die Zielstruktureffektivität und Effekte auf Schaltkreisebene vor der phänotypischen Bildschirmung zu bewerten.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Visualisierung geruchsevozierter Aktivierungsmuster in Glomeruli als funktionelle Module der sensorischen Verarbeitung.
- Operationaler Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch direkte Beobachtung der Aktivierung neuronaler Schaltkreise als Reaktion auf sensorische Reize.
- Prädiktiver Wert: Erleichtert die Portfolio-Priorisierung, indem eine Verbindung zwischen der Modulation von Zielstrukturen und messbaren Veränderungen in räumlichen Aktivierungskarten hergestellt wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Arbeitsabläufe vor, indem Baseline- und evozierte Aktivitätsprofile im Bulbus olfactorius etabliert werden.
- Operativer Wert: Trägt durch sequenzielle Bildgebung intrinsischer optischer Signale und Flavoprotein-Autofluoreszenz unter kontrollierter Stimulation zur Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays bei.
- Skalierbarkeit: Unterstreicht die Wiederverwendbarkeit der Plattform über mehrere Stimulationsdurchläufe und Geruchsstoffe hinweg, um eine zuverlässige Bewertung von Substanzen in der sensorischen Neurowissenschaft zu ermöglichen.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Erläutert die Krankheitsrelevanz, indem Aktivierungsmuster des Riechkolbens mit sensorischen Verarbeitungswegen verknüpft werden, die bei neurologischen Erkrankungen von Bedeutung sind.
- Mechanistische Entlastung von Risiken: Beschreibt den kontinuierlichen Übergang von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem neuronale Reaktionen abgebildet werden, die zielvermittelte Veränderungen der Gehirnaktivität widerspiegeln.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Unterstützt Entscheidungen durch quantitative räumliche Auslesungen, die mit funktionellen Ergebnissen korrelieren.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Hypothesenprüfung in der frühen Entdeckungsphase bis hin zur Leitstrukturfeststellung und präklinischen Validierung, indem sie Messwerte der neuronalen Aktivität liefert, die das Vertrauen in das Zielmolekül und das Verständnis der Wirkmechanismen unterstützen.
- Entdeckungsbiochemie: Erläutert, wie die Methode Hypothesentests, die Aufklärung von Signalwegen und die biologische Risikominderung unterstützt, indem sie die geruchsbedingte Aktivierung in Glomeruli sichtbar macht.
- Screening: Beschreibt die Bereitschaft des Assays, seine Reproduzierbarkeit und quantitative Ergebnisse durch sequenzielle Aufnahmen im Grundzustand und während der Stimulation mit 630 nm und 480 nm Beleuchtung.
- Analytik: Hebt Messgrößen hervor, wie Absorptionsänderungen (intrinsische optische Signale) und Autofluoreszenzemission (Flavoproteinsignale), die einen Vergleich der neuronalen Aktivierung unter verschiedenen Bedingungen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Methode mit der präklinischen Kontinuität, indem sie Aktivierungsmuster im Riechkolben mit sensorischen Verarbeitungswegen in Beziehung setzt, die für therapeutische Zielstrukturen relevant sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt die Methode als wiederverwendbares Verfahren für Langzeitstudien und den Vergleich verschiedener Wirkstoffe in ein und derselben Präparation dar.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit, Zielvalidierung, Verringerung mechanistischer Mehrdeutigkeiten in sensorischen Verarbeitungswegen.
- Operationaler Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit der Abbildung neuronaler Aktivität über Versuchsdurchläufe und Probanden hinweg.
- Strategischer Wert: Verbesserte Go/No-Go-Entscheidungen, Kapital-Effizienz und geringeres biologisches Risiko in fortgeschrittenen Phasen von Neurowissenschaftsprogrammen.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierungs- und Weiterentwicklungsentscheidungen basierend auf Schwellenwerten neuronaler Aktivierung und räumlichen Aktivierungsmustern.
Durchführungsüberlegungen
- Erforderliche wissenschaftliche Fachkenntnisse in den Bereichen Neurowissenschaften, chirurgische Vorbereitung und optische Bildgebungstechniken.
- Notwendige Instrumentierung und analytische Infrastruktur, einschließlich stereotaktischem Rahmen, Stereomikroskop, Lichtquellen bei 580 nm, 630 nm und 480 nm sowie Systemen zur Bildaufnahme.
- Anforderungen an die Standardisierung zwischen Teams hinsichtlich chirurgischer Vorbereitung, Anästhesietiefe und Bildgebungsparameter über verschiedene Labore hinweg.
- Überlegungen zur Anpassung an verschiedene Modellsysteme, wobei aktuelle Anwendungen im Riechkolben der Maus bestehen, mit potenziellem Ausbau auf andere sensorische Regionen.
- Praktische Einschränkungen, die durch die Quellen belegt sind: Unfähigkeit, Riechkarten bei frei beweglichen Mäusen zu visualisieren, sowie begrenzte Photoneneindringtiefe, die den Zugang zu ventralen olfaktorischen Glomeruli einschränkt.
