Identification of Growth Inhibition Phänotypen durch Expression von bakteriellen Typ III Effektoren in Hefe Induced

Um dieses Protokoll zu beginnen, wählen Sie einen Vektor für die Expression Ihres bevorzugten bakteriellen Effektors. In Hefe und Hefestamm wird der Vektor anschließend in Hefezellen transformiert. Danach wird die Expression des Effektors induziert.

Die induzierten Zellen werden lysiert, um anschließend mittels Western Blot die Expression des Effektors zu überprüfen. Nach Bestätigung der Expression werden die Zellen vermehrt und serielle Verdünnungen im Verhältnis 1:10 auf reprimierenden und induzierenden Medien aufgetragen. Schließlich wird nach zwei bis drei Tagen das Wachstum der Hefe analysiert.

Hallo, ich bin Do Solomon aus dem Labor von Dr. Guido Cesa am Department für Pflanzenwissenschaften der Universität Tel Aviv. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Identifizierung von Wachstumsinhibitions-Phänotypen, die durch die Expression bakterieller Effektoren des Typ-III-Sekretionssystems in Hefe hervorgerufen werden. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Funktion von Typ-III-Effektoren gramnegativer pathogener Bakterien zu untersuchen, und es ist ein Werkzeug, das uns bei der Identifizierung der Zielstrukturen (TIC-Ziele) der Effektoren unterstützt.

Beginnen wir also. Bei der Konzeption eines Hefesystems, das für die Expression der interessierenden Typ-drei-Effektoren geeignet ist, sollten mehrere wichtige Faktoren berücksichtigt und optimiert werden. Der erste ist der Promotor, der die Expression der Effektoren steuert.

Da bakterielle Typ-drei-Effektoren für Hefezellen toxisch sein können, sollte ein induzierbarer Promotor zur Kontrolle ihrer Expression verwendet werden. In diesem Experiment verwenden wir den GAL1-Promotor. Der zweite Faktor ist die Kopienzahl des Effektorgens.

Hohe Expressionslevel werden erreicht, wenn das Effektorgen auf einem Zwei-Mikrometer-Plasmid vorliegt. Eine mittlere Expression erhält man durch Verwendung eines Plasmids mit Zentromer, und eine niedrige Expression wird erzielt, wenn das Effektorgen durch homologe Rekombination in das Hefegenom integriert wird. Ein dritter zu berücksichtigender Faktor ist der Epitop-Tag, der zur Überprüfung der Proteinexpression verwendet wird, falls Antikörper gegen den betreffenden Effektor nicht verfügbar sind.

Weit verbreitete Tags sind das M-Hämagglutinin-HA oder Flag-Tag, für die zuverlässige kommerzielle Antikörper verfügbar sind. Wir empfehlen, nur eine Kopie des Tags zu verwenden, um unerwünschte schädliche Effekte auf Struktur und Aktivität des Effektorproteins zu minimieren. Nicht zuletzt muss der Hefestamm, der für die Expression verwendet wird, gegenüber dem selektierbaren Marker des Expressionsvektors tropisch sein.

Um Hefezellen für die Transformation anzuziehen, eine Hefekolonie von einer frischen Platte entnehmen und drei Milliliter YPD in einem 15-Milliliter-Polypropylenröhrchen ansetzen. Das Kulturröhrchen kurz verwirbeln, in einen Rollapparat geben und über Nacht bei 30 Grad Celsius mit konstanter Rotation inkubieren. Am nächsten Morgen die Kultur aus dem Rollapparat nehmen und bei Raumtemperatur fünf Minuten lang mit 800 ×g zentrifugieren.

Nach der Zentrifugation vollständig den Überstand entfernen und die Zellen in einem Milliliter Resus-Suspensionspuffer resuspendieren, indem man etwa 10 Sekunden lang bei maximaler Geschwindigkeit verwirbelt. Für jedes zu transformierende Plasmid sowie eine zusätzliche Kontrolltransformation 100 Mikroliter der Zellsuspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Fünf Mikroliter einsträngige Lachssperma-DNA und 250 bis 500 Nanogramm Plasmid-DNA zu jedem Röhrchen hinzufügen, mit Ausnahme des Kontrollröhrchens.

Fügen Sie anschließend vorsichtig 650 Mikroliter Transformationslösung zu jedem Röhrchen hinzu und wirbeln Sie es kurz an. Inkubieren Sie die Röhrchen 30 Minuten lang bei 30 Grad Celsius auf einem Rollapparat. Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, geben Sie 70 Mikroliter DMSO zu jedem Röhrchen hinzu und mischen Sie die Lösung durch 10 bis 15maliges Vorsichtig-Invertieren der Röhrchen, um ein Beschädigen der Zellen zu vermeiden.

Vortexen Sie die Röhrchen nicht. Stellen Sie die Röhrchen in ein auf 42 Grad Celsius vorgewärmtes Wasserbad und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang. Nach 15 Minuten nehmen Sie die Röhrchen aus dem Wasserbad und stellen Sie sie unverzüglich für zwei Minuten auf Eis.

Nachdem die Röhrchen abgekühlt sind, die Zellen durch Zentrifugation gewinnen und anschließend mit einer Pipette vorsichtig den viskosen Überstand entfernen. Jedes Pellet in 150 Mikroliter sterilem, doppelt destilliertem Wasser resuspendieren und die Zellsuspension auf einer Platte mit dem geeigneten selektiven Medium ausstreichen. Die Platten zwei Minuten offen stehen lassen und in einer laminaren Luftströmung trocknen lassen.

Danach die Platten für zwei bis drei Tage in einen 30 Grad Celsius warmen Inkubator stellen, um Hefezellen wachsen zu lassen. Zum Herstellen eines Proteinauszugs drei Milliliter des geeigneten reprimierenden Mediums mit einer Hefekolonie von einer frischen Platte ansäen und vortexen. Am folgenden Tag das Kulturgefäß kurz auf einen Rollapparat bei 30 Grad Celsius stellen.

Entfernen Sie die Kultur vom Rolleninkubator und zentrifugieren Sie sie bei Raumtemperatur fünf Minuten lang mit 800 G, entfernen Sie das Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet. In drei Milliliter sterilem DDW, durch Vortexen gemischt, zentrifugieren Sie erneut, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in drei Milliliter sterilem DDW. Überführen Sie nun 200 Mikroliter der Zellsuspension in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen, das drei Milliliter des geeigneten Induktionsmediums enthält, das durch Vortexen gemischt wurde.

Stellen Sie das Reagenzglas in einen Rollapparat und inkubieren Sie es über Nacht bei 30 Grad Celsius. Am folgenden Morgen überführen Sie ein Milliliter der Kultur oder mehr bei Kulturen mit geringer Dichte in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 800 × g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Ab diesem Punkt arbeiten Sie in einer Abzugshaube, um ein Einatmen toxischer Beamer capto Ethanol-Dämpfe zu vermeiden.

Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mithilfe eines Pipettiergeräts und resuspendieren Sie das Zellpellet in 100 Mikrolitern eiskalter Lysepufferlösung. Vermischen Sie kräftig durch Vortexen und inkubieren Sie 30 Minuten auf Eis. Während der 30-minütigen Inkubation bestimmen Sie das Volumen an sechsfach normaler Salzsäure, das zur Titration von 100 Mikrolitern Lysepuffer auf einen pH-Wert von 9 bis 10 erforderlich ist.

Fügen Sie dazu verschiedene Volumina Salzsäure zu 100 Mikrolitern Lysepuffer in 10 verschiedenen Röhrchen hinzu und überprüfen Sie den pH-Wert der Lösung mithilfe eines pH-Indikatorstreifens am Ende der Inkubation bei dem geeigneten Volumen Salzsäure im Lysat und mischen Sie durch Vortexen. Anschließend geben Sie 50 Mikroliter dreifachen Probenpuffer zum Lysat und mischen durch Vortexen. Stellen Sie ein Loch in den Deckel des Mikrozentrifugenröhrchens mit einer Nadel und erhitzen Sie die Lysatlösung fünf Minuten lang auf einem Heizblock. Lassen Sie die Lösung nach dem Erhitzen zwei Minuten bei Raumtemperatur abkühlen.

Anschließend die Lyssatlösung vortexen und für 10 Sekunden abzentrifugieren. Der Lysat ist nun bereit für die immunochemische Blutanalyse, um die Zellen für den Spotting-Assay vorzubereiten. Kultivieren Sie am folgenden Tag drei Milliliter Kulturen jedes Stammes, wie zuvor gezeigt.

Bereiten Sie zwei Platten mit synthetischem komplettem Medium ohne Leucin vor. Das Medium einer Platte sollte mit 2 % Glucose ergänzt werden, das der anderen Platte mit 2 % Galactose und 1 % Raffinose. Trocknen Sie die Platten 20 Minuten lang bei Raumtemperatur in einer sterilen Lamellenstromwerkbank.

Die Zellen gewinnen und jedes Zellenpellet in drei Milliliter sterilem DDW resuspendieren. Den Zentrifugationsschritt wiederholen und die Zellen erneut in drei Milliliter sterilem DDW resuspendieren. Die optische Dichte oder OD jeder Kultur bestimmen und anschließend einteilige Zellsuspensionen mit einem OD 600 von eins in sterilen Mikrofichenschläuchen herstellen.

Bereiten Sie anschließend drei zehnfache serielle Verdünnungen von jeder Zellsuspension mithilfe von drei sterilen Mikroröhrchen vor, die jeweils mit 900 Mikrolitern sterilem DDW gefüllt sind. Stellen Sie die trockenen Platten auf ein Raster und geben Sie für jeden Kulturpunkt jeweils 10 Mikroliter aus den vier Verdünnungen in einer Reihe auf. Lassen Sie die Platten nach dem Auftragen einige Minuten lang im Sicherheitswerkbank offen stehen.

Wenn die Flecken trocken sind, decken Sie die Platten ab und stellen Sie sie für zwei bis drei Tage in einen 30 Grad Celsius warmen Inkubator. Nun zeigen wir Ergebnisse aus einem Hefe-Auftragsassay zur Detektion von Wachstumshemmung. Phänotypen, die durch die Expression von Typ-drei-Effektoren induziert werden, hier die Typ-drei-Effektoren A-V-R-P-T-O hop, AA one one und AAV RE one des Bakteriums.

Pseudomona-Riner-Pfad unseres Tomatens wurde aus einem Plasmid mit Zentromer in einem Hefestamm auf reprimierendem Medium exprimiert. Hefestämme, die ein Plasmid zur Expression von A-V-R-P-T-O und HOP-AA-eins-eins trugen, zeigten ein ähnliches Wachstum wie der Kontrollstamm mit leerem Vektor. Während Hefe, die AAV-RE-eins trug, ein leicht vermindertes Wachstum zeigte, wahrscheinlich aufgrund von Leckage des GAL-eins-Promotors und der hohen Zytotoxizität von AV-RE-eins, führte unter induzierenden Bedingungen die Expression entweder von AV-E-eins oder HOP-AA-eins-eins zu einer drastischen Wachstumshemmung, die sich im Fehlen von Kolonien in jeder Verdünnung widerspiegelte. Im Gegensatz dazu übte die Expression von A-V-R-P-T-O keinerlei wachstumshemmende Wirkung aus.

Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man Wachstumshemmungsphänotypen identifiziert, die durch die Expression bakterieller Typ-III-Effektoren in Hefe verursacht werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sorgfältig sowohl den Expressionsvektor als auch den Stamm auszuwählen, da beide die Ergebnisse erheblich beeinflussen können. Außerdem sollten Sie stets frisch transformierte Kolonien in allen Schritten des Verfahrens verwenden.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.