Live-Cell-Imaging und Quantitative Analyse der embryonalen Epithelzellen in Xenopus laevis

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Live-Bildgebung und einfache Quantifizierungsmethoden zur Analyse der Morphologie embryonaler epithelialer Zellen zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst alle Werkzeuge und Geräte bereitgestellt werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, X explan aus Froschembryonen zu entnehmen und sie in Kammern für eine Langzeitkultur unterzubringen.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, hochauflösende Bilder von Epithelzellen in Echtzeit aufzunehmen. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Quantifizierung morphologischer Details von Epithelzellen mithilfe von ImageJ. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die verfolgte Zellareale und Membranintensitäten mittels hochauflösender konfokaler Mikroskopie zeigen. Hallo, ich bin Sagar Joshi vom Davidson Laboratory am Department für Bioingenieurwesen der University of Pittsburgh.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Live-Cell-Bildgebung und quantitativen Analyse embryonaler epithelialer Zellen von Xenos lavia. Wir verwenden dieses Verfahren, um Echtzeit-Veränderungen des Zellzytoskeletts zu untersuchen. Beginnen wir also.

Um Kammern für die Kultivierung von Animal-Cap-Explanten vorzubereiten, verwenden Sie Silikonfett, um eine benutzerdefinierte Acrylkammer oder eine kleine Nylonunterlegscheibe auf einem großen Deckglas mit den Maßen 45 mal 50 Millimeter abzudichten. Geben Sie ein Milliliter 1 % BSA in einem Drittel XMBS in die Kammer. Beschichten Sie kleine Deckglasstücke mit derselben Lösung und inkubieren Sie sie zwei bis vier Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius.

Um die Adhäsion des X-Explanten an dem Glas zu verringern, spülen und füllen Sie die Kammer mit DFA-Medium, kurz bevor die Xs übertragen werden. Spülen Sie die Deckglasfragmente auf dieselbe Weise ab. Tauchen Sie sie dann in eine Schale mit DFA-Kultur-Embryonen, die im Ein- bis Vierzellstadium mit der gewünschten MRNA bis zum gewünschten Stadium in einem Drittel XMBS mikroinjiziert wurden. Verwenden Sie eine Transferpipette mit schrägem Öffnungsende, um die Embryonen unter einem Stereomikroskop in eine Schale mit DFA zu überführen.

Verwenden Sie eine Pinzette, um die Embryonen zu fixieren, um eine tierische CapEx-Anlage zu entnehmen. Benutzen Sie eine Haarschleife, um einen Embryo in einer Position zu stützen. Nutzen Sie ein Haarmesser, um eine kleine Inzision am animalen Pol vorzunehmen.

Führen Sie wiederholte, gleichmäßige Schnitte aus, um den Einschnitt zu verlängern und das Kappektoderm zu entfernen. Entfernen Sie drei oder vier x explan auf die gleiche Weise und verwenden Sie eine Transferpipette, um sie in die vorbereitete Kulturkammer zu bringen.

Platzieren Sie mithilfe der Haarschleife jedes X-Explan so, dass das Epithel zur Kammerunterseite weist. Halten Sie ein Deckglasfragment mit der Pinzette in der Mitte fest.

Tauchen Sie die Enden in Silikonfett. Legen Sie ein Fragment über jedes X-Explan. Befestigen Sie jedes Fragment leicht mit kleinen Tupfern Silikonfett an seiner Stelle.

Darauf achten, den X-explan nicht mit übermäßiger Kraft vollständig zu zerquetschen. Die Kammer mit DFA füllen und die oberen Kanten der Kammer mit Silikonfett beschichten. Anschließend die Oberseite mit einem 24 x 40 Millimeter großen Deckglas versiegeln.

Stellen Sie den Pegel des DFA in der Kammer ein, um Luftblasen zu reduzieren, und tupfen Sie mit einem Tuch jeglichen Überlauf ab. Die X-Pflanzen können nun langfristig für einen Tag bei Raumtemperatur in der verschlossenen Kammer kultiviert werden; bringen Sie das 20×-Objektiv eines konfokalen Mikroskops in Position. Platzieren Sie die Kammer mit dem X-Explant auf dem Mikroskopständer und legen Sie kleine Ausgleichsgewichte auf die Kammer, um sie unter Hellfeldbedingungen festzuhalten.

Stellen Sie den Fokus ein und verwenden Sie die grobe Positionierung, um die apikalen Enden der oberflächlichen Zellen sichtbar zu machen. Wechseln Sie zur Fluoreszenz und einem Objektiv mit höherer Vergrößerung. Um Einzelbilder oder Zeitrafferaufnahmen des explantierten Epithels aufzunehmen, optimieren Sie die Aufnahme, um das bestmögliche Bild zu erhalten.

Beziehen Sie sich auf den schriftlichen Teil dieses Protokolls für Hinweise zur Justierung und Bildgebung. Halten Sie die Laserleistung so niedrig wie möglich. Nehmen Sie Bilder oder zeitraffende Filme des x explan Epithels auf.

Beachten Sie den schriftlichen Teil des Protokolls für Vorschläge zur Datensammlung. Konfokale Bilddateien können auf verschiedene Weisen zur Datenanalyse genutzt werden. Hier sind zwei Beispiele, wie man Datendateien mithilfe der Bildanalyse-Software ImageJ mit Bio-Formats-Plugin analysiert.

Um die Zellfläche einer epithelialen Zelle zu messen, ziehen Sie das Menü „Analyze“ herunter und klicken Sie auf „Set Measurements“. Wählen Sie das Auswahlwerkzeug aus der Symbolleiste und umranden Sie die Zelle. Gehen Sie im Menü „Analyze“ auf „Tools“ und anschließend auf „ROI Manager“. Um den Manager für interessierende Bereiche zu öffnen, drücken Sie Strg+T.

Um die Konturen dem ROI-Manager hinzuzufügen, wählen Sie beliebig viele Konturen aus dem Bild aus und fügen Sie sie hinzu. Klicken Sie dann auf „Speichern“, um den ROI-Satz im ROI-Manager zu speichern. Klicken Sie auf „Messen“.

Das Ergebnisfenster zeigt nun die gemessenen Flächen jeder ROI an. Um die Intensität einer Zellmembran zu messen, wählen Sie das Linienzeichentool aus der ImageJ-Symbolleiste aus. Zeichnen Sie eine senkrechte Linie über die Membran.

Drücken Sie STRG+T wie im vorherigen Beispiel. Um die Auswahl dem ROI-Manager hinzuzufügen, öffnen Sie das Analyse-Menü und klicken Sie auf Profil plotten, um ein Diagramm der relativen Intensitäten entlang der Linie zu erzeugen. Um das Diagramm als Bild zu speichern, klicken Sie im neu erscheinenden Plot-Fenster auf Speichern.

Klappen Sie das Listenmenü nach unten auf „Datei“ und dann auf „Speichern unter“. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man lebende Bilder von embryonalen epithelialen Zellen aus ausgeschnittenen Animal-Cap-Explantaten aufnimmt und quantifiziert. Während dieses Verfahrens ist es wichtig, Antibiotikum und Antibiotikum dem DFA hinzuzufügen. Um bakterielles und pilzliches Wachstum zu verhindern, achten Sie besonders darauf, die Explantate unter den Deckgläsern vorsichtig zu drücken, da ein zu starker Druck das Explantat zerquetschen kann.

Es ist außerdem wichtig, daran zu denken, am konfokalen Mikroskop optimale Einstellungen zu wählen, um Bildergebnisse von maximaler Qualität zu erhalten. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.