T-Wellen-Ionen-Mobilitäts-Massenspektrometrie: Basic Experimentelle Verfahren zur Protein Complex Analysis

Das allgemeine Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Gesamtstruktur von Protein-Komplexen zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem Massenspektrometrie-Ionenmobilitätsdaten für Protein-Komplex-Ionen gewonnen und die Driftzeitwerte jedes Ladungszustands gemessen werden. In einem zweiten Schritt werden die experimentellen Bedingungen validiert, um sicherzustellen, dass Mobilitätsmessungen an nativen Proteinstrukturen durchgeführt werden.

Anschließend werden die gemessenen Driftzeitwerte mit den Querschnittsflächen korreliert. Die Ergebnisse liefern die Kollisionsquerschnittswerte von Proteinen oder Protein-Komplexen mit unbekannten dreidimensionalen Strukturen. Diese Informationen geben Hinweise auf ihre Gesamtform, die Anordnung der Untereinheiten sowie die Topologie.

Hallo, ich bin Isaac Leski aus dem Labor von Mic, Abteilung für Biochemie am Wiseman-Institut für Wissenschaften, und ich bin Naam Kirschenbaum, ebenfalls aus dem Labor von mi. Heute werden wir ein Verfahren zur Messung des Kollisionsquerschnitts von Protein-Komplexen mithilfe hybrider Massenspektrometrie und Ionenmobilitätsinstrumente vorstellen. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Gesamtform und die räumliche Organisation von Protein-Komplexen zu untersuchen.

Beginnen wir also. Dieses Verfahren konzentriert sich auf die Eisenmobilität und die Massenspektrometrie oder IMM-MS-Analyse von Protein-Komplexen. Die Schritte zur Probenvorbereitung, die Instrumentenkalibrierung sowie die Optimierungsverfahren für die MS- und Tandem-MS-Analyse werden in einem verwandten JO-Protokoll demonstriert.

Im Allgemeinen beinhaltet dieses Protokoll niedrige mikromolare Konzentrationen des Komplexes in einem flüchtigen Puffer wie Ammoniumacetat. Da ein bis zwei Mikroliter pro Nanoflow-Kapillare verbraucht werden, bereiten Sie mindestens 10 bis 20 Mikroliter vor, um die Optimierung der MS-Bedingungen zu ermöglichen. Um dieses Verfahren zu beginnen, stellen Sie die Traveling-Wave- oder T-Wave-Synap-IMMS auf die folgenden Betriebsmodi ein: Mobilität TOF, wobei die Tri-Wave und die Drücke automatisch sowohl für die IM- als auch für die Time-of-Flight-Trennung von Ionen eingestellt sind, sowie auf Positiv-Ionen-Erfassung und V-Modus, wodurch der Weg der Ionen durch das Flugrohr festgelegt wird, und schalten Sie hier alle Gase ein.

Stickstoff wird für die IM-Trennung und Argon für die Fang- und Transferbereiche verwendet. Empfohlene Anfangswerte sind ein Gasfluss von 24 Millilitern pro Minute für die IMS-Vorrichtung und 1,5 Milliliter pro Minute für den Fangebereich. Anschließend wird der Erfassungsbereich für das Mastladungsverhältnis für einen unbekannten Proteinkomplex eingestellt.

Verwenden Sie zunächst einen breiten Massenbereich, der anschließend auf die gewünschten Werte reduziert werden kann, und stellen Sie das MS-Profils entsprechend ein. Für maximale Transmissions-Effizienz bei großen Komplexen sollte der Erfassungs-Massenbereich von 1030 bis 2000 MA-Ladungsverhältnis eingestellt und das MS-Profil auf Automatik gesetzt werden. Andernfalls kann das Profil gemäß der dargestellten Tabelle eingestellt werden.

Überprüfen Sie die RF-Einstellung und passen Sie sie gegebenenfalls an die für große Protein-Komplexe geeigneten Werte wie gezeigt an. Laden Sie anschließend die Probe auf, geben Sie Kapillarspannung und niedrigen Nano-Fluss-Druck an. Sobald die Sprühung beginnt, versuchen Sie, den Nano-Fluss-Druck auf einen minimalen Wert zu reduzieren.

Stellen Sie außerdem die Position der Kapillare in Bezug auf den Konus ein und passen Sie die MS-Akquisitionsparameter an, um ein gut aufgelöstes MS-Spektrum aufzuzeichnen. Optimieren Sie den Druckgradienten entlang des Instruments und des Probeneinspeisekonuses sowie die Potentialverhältnisse des Extraktionskonuses, der Bias-Falle und des Transfers, wie im zugehörigen JoVE-Protokoll beschrieben. Obwohl diese Parameter probenspezifisch sind, werden hier die Bedingungen angegeben, die zur Aufnahme von MS-Spektren verschiedener Eisenmassen – von Peptid- bis zu Protein-Komplexen – verwendet wurden.

Große Ionen erfordern höhere Kollisionsenergien und eine höhere Vorspannungsspannung. Es wird außerdem empfohlen, den Gegendruck bei der Analyse großer Protein-Komplexe zu erhöhen, um die Aktivierung des Komplexes zu minimieren. Versuchen Sie, die Extraktionsspannung des Probenkegels, die Kegelfallen- und die Vorspannungsspannungen schrittweise in etwa 10-Volt-Schritten zu verringern, ohne die Position des Peaks zu verändern.

Nachdem ein optimales Massenspektrum erhalten wurde, sollte die Driftzeit oder IM-Profil bei der Analyse von Protein-Assemblierungen angepasst werden. Optimale Bedingungen sowohl für die Massen- als auch für die Mobilitätsmessung sind oft unvereinbar. Daher ist es wichtig, einen geeigneten Kompromiss zwischen beiden zu finden.

Im Allgemeinen sollte das Eisen-Mobilitätsdiagramm so optimiert werden, dass die Peaks über den gesamten Driftzeitbereich verteilt sind und das Peak-Profil glatt ist. Wenn sich die Verstärkung der Verteilung nähert, kann eine signifikante Peak-Asymmetrie auf eine unzureichende Trennung mehrerer Konformationen zurückzuführen sein. Die T-Wellen-Geschwindigkeit, die T-Wellen-Höhe und die IMS-Gasflussrate können angepasst werden, um die Mobilitätstrennung zu optimieren. Eine Erhöhung der T-Wellen-Geschwindigkeit verbreitert das Driftzeitverteilungsprofil.

Während erhöhte T-Wellen-Höhenwerte sie ähnlich verengen, verschiebt bereits ab einem Minimum von 10 Millilitern pro Minute ein Anstieg des IMS-Gasflusses das Driftzeitprofil in Richtung höherer Werte und dient der Optimierung des Eisenmobilitätsspektrums. Indem zwei der drei Variablen festgelegt und die dritte optimiert werden, stellen Sie die T-Wellen-Geschwindigkeit auf 250 Meter pro Sekunde und den Gasfluss auf 24 Milliliter pro Minute ein. Danach als Ausgangspunkt die Höhe auf drei Volt einstellen und schrittweise in Ein-Volt-Schritten erhöhen.

Wenn hohe Vorspannungsspannungen verwendet werden, wird empfohlen, den Druck des IMS-Gases zu verringern und auf diese Weise eine Absenkung der Vorspannungsspannung zu ermöglichen. Dadurch werden komplexe Aktivierungs- und Dissoziationsprozesse reduziert. Ein Roll-over-Effekt kann auftreten, wenn die Bedingungen nicht optimiert sind, und zeigt sich als identischer Peak im ersten Teil des Driftzeitenspektrums und am ausklingenden Rand.

Wenn die Ionen das IAM-Gerät nicht durchlaufen, kann ihre Reise länger dauern als die Zeit, die für die Freisetzung des nächsten Eisenpaketes in die Mobilitätszelle erforderlich ist. Dadurch wird ein neuer Ionenpuls aus dem Fallenbereich freigesetzt, bevor das vorherige Paket an den Pusher-Bereich übergeben wurde. Um diesen Artefakt zu beseitigen, erhöhen Sie die T-Wellenhöhe und verringern Sie die T-Wellengeschwindigkeit sowie den IMS-Druck.

Außerdem kann die Freigabezeit der Falle angepasst werden. Darüber hinaus ist es wichtig zu überprüfen, ob die Übertragungs-T-Welle auf mindestens fünf Volt eingestellt ist, um zudem ein Austreten von Ionen in Richtung der IMS-Zelle zu verhindern.

Die Höhe der Mobilitätsfalle sollte auf maximalen Werten gehalten werden. Geringe Geschwindigkeit und hohe Amplitude der Transfer-T-Wellen können zu einer Wellenbildung des Driftzeitverteilungsprofils führen. Dieser Artefakt tritt auf, wenn die Mobilitätstrennung der Ionen im Transfer- und im Tough-Bereich aufgrund einer teilweisen Synchronisation zwischen der Push-Frequenz und der Transfer-T-Wellen-Geschwindigkeit nicht aufrechterhalten wird.

Um diesen Effekt zu eliminieren, sollte entweder die Pusher-Zeit oder die Transfer-T-Wellen-Geschwindigkeit angepasst werden. Da die Pusher-Frequenz mit dem Massenbereich verknüpft ist, kann dieses Artefakt erneut auftreten, wenn dieser Parameter geändert wird.

Die T-Wellen-Amplitude übt einen geringen Einfluss aus. Obwohl ihre Verringerung ebenfalls dazu beitragen kann, Rippel zu eliminieren. Sobald die oben genannten Parameter optimiert sind, können die IMMS-Daten erfasst werden, um eine hohe Auflösung zu erreichen.

MS.Peaks-Protein-Komplexe werden häufig innerhalb des Massenspektrometers aktiviert, um die Ablösung von restlichem Wasser und Pufferbestandteilen zu fördern. Wenn jedoch die Aktivierungsenergie einen Schwellenwert überschreitet, kann es zu einer teilweisen Entfaltung kommen, wodurch mehrere Zwischenzustände entstehen, die wahrscheinlich nicht der nativen Struktur im Lösungszustand entsprechen. Infolgedessen kann sich der Driftzeit-Peak verschieben und verbreitern, was auf eine heterogene Population entfalteter Strukturen hinweist.

Um Driftzeitdaten zu erhalten, die mit den Strukturen in Lösung übereinstimmen, ist es entscheidend, die zur Ionenbeschleunigung vor der IM-Trennung verwendeten Spannungen sorgfältig zu kontrollieren. Erhöhen Sie daher Kapillar- und Konuspannung schrittweise, während Sie den Einfluss auf das Driftzeitspektrum überwachen. Darüber hinaus ist es für eine hohe MS-Auflösung vorzuziehen, die Transfer- anstelle der Trap-Spannung zu erhöhen. Die IM-Vorrichtung ist zuerst positioniert, gefolgt vom Transferbereich und dem TOF-Analysator.

Da die Aktivierung der IM-Messung folgt, bleiben die Werte für IM unbeeinflusst, während die MS-Genauigkeit erhöht werden kann, um sicherzustellen, dass die Datenaufnahme unter Bedingungen erfolgt, die die native Struktur des Komplexes bewahren. Daher ist es wichtig, Daten über eine Reihe experimenteller und lösungsbedingter Parameter zu sammeln, anstatt sich auf einen einzigen optimierten Parametersatz zu beschränken. Erhöhen Sie aus diesem Grund die Trap-Kollisionspannung schrittweise und nehmen Sie Daten in 10-Volt-Intervallen auf, während Sie den Einfluss auf das Eisen-Mobilitätsprofil überwachen. Schließlich, um die entfalteten Konformationen zu identifizieren und die erfassten Daten manuell zu bewerten, induzieren Sie die Dissoziation des Protein-Komplexes durch Titration der Probe mit Essigsäure über einen pH-Bereich von zwei bis sieben, nehmen Sie die Daten auf und fahren Sie fort mit der Analyse der Daten im T-Wave-IMS-System anhand der querschnittsflächen, die durch einen Driftzeit-Kalibrierungsansatz definiert sind, unter Verwendung von Cain-Proteinen mit bekannten Querschnittswerten.

Zunächst bereiten Sie denaturierte Kalibrierproteinslösungen jeweils in einer Konzentration von 10 µM vor. Verwenden Sie equines Cytochrom C, Herz-Myoglobin aus Pferd und bovines Ubiquitin im Volumenverhältnis 49:49:0,2 von Wasser:Methanol:Essigsäure. Danach nehmen Sie IMMS-Daten der Kalibrierproteine unter exakt denselben Gerätebedingungen auf, die auch für das Zielprotein oder den Zielproteinkomplex verwendet wurden, und halten Sie alle Spannungswerte und Druckwerte identisch, um die IM-Trennbedingungen beizubehalten.

Nach der Datenaufnahme extrahieren Sie den experimentellen Driftzeitwert für jede Ladung. Korrigieren Sie mithilfe der folgenden Gleichung die jeweiligen Kaliber-Driftzeiten T′D der Cain-Proteine, wobei MOVZ das Hauptladungsverhältnis des beobachteten Ions und C der Koeffizient für die Verzögerung des verbesserten Tastverhältnisses (EDC) ist. Der Wert von C liegt typischerweise zwischen 1,4 und 1,6 und ist geräteabhängig.

Der EDC-Wert wird in den Aufnahmeeinstellungen des Systems angegeben, in einem Register für die Aufnahmekonfiguration, und korrigiert jeden der Kaliber-Querschnitte sowohl für den Eisenladungszustand als auch für die reduzierte Masse. Dabei ist omega C der korrigierte Querschnitt, omega der Literaturquerschnitt, Z der Eisenladungszustand, M das Molekulargewicht des Kationen-Ions und MG das Molekulargewicht des Eisens.

Hintergrundgas, das typischerweise Stickstoff ist, im Vergleich zu T' D gegen ω C. Die resultierende Kurve entspricht der folgenden Gleichung. Die Parameter X und A können durch Anpassen der Darstellung an einen linearen Zusammenhang gewonnen werden. Die Steigung X entspricht dem exponentiellen Proportionalitätsfaktor, und A stellt die aus der Anpassung ermittelte Konstante dar.

Berechnen Sie den Anpassungskorrelationskoeffizienten R-Quadrat. Akzeptable Werte für R-Quadrat liegen über 0,95. Ein niedrigerer Wert des Korrelationskoeffizienten kann auf eine unvollständige Entfaltung des Proteins oder eine Alterung der Probe zurückzuführen sein.

Unterschiedliche experimentelle Bedingungen, die für Proteine verschiedener Größe verwendet wurden, ein verrauschtes Spektrum sowie eine unvollständige Datenverarbeitung oder Rechenfehler. Korrigieren Sie die Ca-Wanderzeit unter Verwendung des bestimmten exponentiellen Faktors X und validieren Sie Ihre Berechnungen, indem Sie Omega C über T-Strich D erneut auftragen. Definieren Sie erneut den Korrelationskoeffizienten. Höhere Werte als 0,95 sind zu erwarten, vergleichbar mit den zuvor beschriebenen Schritten. Korrigieren Sie die gemessene Wanderzeit des Zielproteins oder des Protein-Komplexes und kalibrieren Sie die Wanderzeit des Zielproteins oder des Protein-Komplexes unter Verwendung des berechneten exponentiellen Faktors X. Berechnen Sie Omega des Zielproteins oder des Protein-Komplexes unter Verwendung der bestimmten Konstanten A, wobei Omega gleich a mal T D ist. Wiederholen Sie diese Schritte für jede experimentelle Bedingung.

Bei der Bestimmung der Querschnittsfläche eines unbekannten Proteins oder Protein-Komplexes empfehlen wir, jedes Experiment mindestens dreimal zu wiederholen und die Standardabweichung dieser dreifachen Messungen zu ermitteln, sobald die Werte für den Kollisionsquerschnitt bestimmt sind. Modellierungsansätze werden verwendet, um die topologische Anordnung des Komplexes vorherzusagen. Dies geschieht durch Anpassung der experimentell ermittelten Kollisionsquerschnittswerte an in silico berechnete Omega-Werte, die aus generierten Modellstrukturen abgeleitet werden. Insgesamt befindet sich dieses Forschungsfeld noch in einem frühen Entwicklungsstadium, und es sind weitere Fortschritte erforderlich, um diesen Ansatz allgemeingültig und auf eine breite Palette von Komplexen anwendbar zu machen.

Die Oberflächendarstellung der tetrameren Form von bovinem Hämoglobin ist hier dargestellt. Der Sauerstofftransporteur Hämoglobin-Komplex kann als Beispiel für den oben genannten Ansatz dienen. Hämoglobin ist ein tetrameres Proteinkomplex, der aus zwei alpha- und zwei beta-Untereinheiten besteht, die jeweils blau und rot gefärbt sind und einen Dimer aus alpha-beta-Dimeren bilden.

Das IMMS-Spektrum von Hämoglobin ist hier dargestellt. Das aufgezeichnete IM-Ms-Spektrum des Komplexes zeigt eine hauptsächliche Ladungsserienverteilung, die dem intakten Komplex entspricht, sowie Nebenladungsserien, die den Massen des Alpha-Beta-Dimers und der alpha- und beta-monomeren Untereinheiten entsprechen. Der theoretische und gemessene CCS der verschiedenen Formen von Hämoglobin ist hier dargestellt.

Für mehrere Ladungszustände der dimeren und tetrameren Formen ermittelte Driftzeitwerte wurden zur Berechnung der Omega-Werte verwendet. Diese wurden mit den theoretischen Werten verglichen. Da ein tetrameres Komplex drei Assoziationsmöglichkeiten aufweist – entweder zyklisch, dihedrisch oder kettenartig angeordnet – erfolgte der Vergleich entsprechend.

Indem man die Zunahme von Omega bei dem Übergang von einem Dimer zu einem Tetramer berechnet, kann die strukturelle Organisation vorhergesagt werden. Frühere Studien und unsere eigenen Experimente haben eine starke Korrelation zwischen gemessenen ccss-Werten und Protein-Oberflächenbereichen gezeigt, die aus kristallographischen Strukturdaten abgeleitet wurden. Diese Korrelation kann verwendet werden, um die erwartete Zunahme der Oberfläche eines Tetramers im Vergleich zu einem Dimer für die verschiedenen Packungsformen zu berechnen.

Dies erfolgt, indem jedes Untereinheit-ähnliche Objekt als asphärisch betrachtet wird. Eine kettenartige Anordnung erhöht den CCS-Wert des Tetramers um etwa das Doppelte, während eine C4- oder D2-Packung eine Erhöhung um etwa 1,5 bzw. 1,67 ergibt. Das berechnete Verhältnis zwischen den gemessenen CCS-Werten der tetrameren und der DME-Form von Hämoglobin betrug 1,57 ± 0,03.

Diese Zahl verdeutlicht, dass die native Struktur nicht linear organisiert ist, sondern in einer kompakteren Form vorliegt, entweder als zyklisches oder dihedrales Tetramer. Bei Wiederholung der gleichen Berechnung an der aufgeklärten Kristallstruktur von Hämoglobin betrug das Verhältnis der Oberflächenflächen von tetrameren zu DME-Formen 1,63, was einer D2-Symmetrie entspricht. Offensichtlich war dieses geometrische Modell vereinfacht, und Proteinsubeinheiten sind nicht einfach nur kugelförmig.

Diese Berechnung zeigt jedoch das aufregende Potenzial von IMMS auf, die Packung von Komplexen mit unbekannten Strukturen in hoher Auflösung aufzudecken. Ich habe Ihnen gerade gezeigt, wie man die Driftzeit des Proteins und der Protein-Komplexe misst und wie man ihre Kollisionsquerschnittswerte berechnet. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die IMMS-Daten für die Kalibrierproteine unter exakt denselben Bedingungen zu erfassen, die auch für das Zielprotein oder die Protein-Komplexe verwendet werden.

Außerdem empfehlen wir dringend, diese Experimente mindestens dreimal zu wiederholen und die Standardabweichung dieser tripelten Messungen zu bestimmen. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.