Profiling Thiolredox Proteome Mit Isotopen-Massenspektrometrie Tagging

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die Wirkung von Pseudomona siro PV Tomato auf redoxregulierte Proteine in Tomatenpflanzen zu beobachten. Inokulieren Sie zunächst Tomatenpflanzen mit Pseudomona siro PV PV Tomato, um eine Pathogeninfektion und Proteinausprägung hervorzurufen. Färben Sie anschließend mit DIAM-Benzin, um Veränderungen der reaktiven Sauerstoffspezies sichtbar zu machen.

Danach erfolgt die Zystein-TMT-Markierung, um redoxregulierte Cysteine in Proteinen zu untersuchen. Die erhaltenen Ergebnisse können Veränderungen zwischen behandelten und Kontrollproben messen. Hallo, ich bin Chen aus der Abteilung Biologie und Proteomik-Facility hier an der University of Florida.

Der Vorteil unseres CTMT-Markierungsverfahrens gegenüber bestehenden Methoden wie dem mit Isotopen beschichteten Flossenmarkierer, auch bekannt als ASCA, liegt in der Möglichkeit der Multiplexanalyse redoxreaktiver Proteine im großen Maßstab. Während diese Demonstration Einblicke in rotregulierte Proteine der Tomate im Zusammenhang mit Pathogeninfektionen vermitteln wird, kann das Experiment auch auf andere Systeme wie joof, Mäuse cu sowie andere Pflanzen und die Kontrolle unter Stressbedingungen angewendet werden. Die Idee zu dieser Methode entstand erstmals, nachdem wir starke Variationen zwischen ICAD-Experimenten beobachtet hatten, da lediglich zwei Markierungen verfügbar sind.

Die VIR-Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Markierungs- und Anreicherungsschritte schwer zu erlernen sind. Experimentelle Variationen zwischen markierten Proben müssen minimiert und entfernte Bereiche beseitigt werden, um eine effiziente Markierung sicherzustellen. Beginnen wir. Züchten Sie zwei transplantierte Tomatensämlinge ähnlicher Größe in Töpfen mit einem Durchmesser von vier Zoll für die Inokulumkultur.

Ein Rasen von Pseudomonas singe auf einer KBM-Platte. Die Bakterien in 20 Milliliter Wasser abkratzen und ein Bakterieninokulum mit einer Konzentration von etwa 10⁶ koloniebildenden Einheiten pro Milliliter herstellen. Vier Wochen alte Pflanzen für 30 Sekunden in eine Liter Inokulationspufferlösung mit dem Bakterieninokulum eintauchen.

Danach sofort mit durchsichtigen Plastiktüten abdecken. Nach der gewünschten Inokulationszeit das vollständig entfaltete Blatt entnehmen, epidermale Seite nach oben platzieren, in einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter DAB-Anfärbung geben und 15 Minuten unter Vakuum infiltrieren. Anschließend die Blätter über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.

Kochen Sie die angefärbten Blätter nun 10 Minuten lang in 95 % Ethanol und lagern Sie sie in 75 % Ethanol unter Verwendung eines Mörser zur Zerkleinerung. Die geernteten Blätter werden in flüssigem Stickstoff zu einem feinen Pulver zermahlen. Führen Sie anschließend Phenolextraktionen wie im begleitenden Text beschrieben durch.

Als Nächstes präzipitieren Sie die phenolextrahierten Proteine mit dem Fünffachen des Volumens kaltem 0,1-molarer Ammoniumacetatlösung in 100 % Methanol. Sammeln Sie die Proteine durch Zentrifugation und führen Sie Pellet-Waschschritte durch. Suspendieren Sie die Proben anschließend erneut in 1,5 Milliliter kaltem 70 %igem Ethanol und überführen Sie sie in eine 2-Milliliter-Mikrozentrifugenprobe.

Nach der Zentrifugation das Ethanol-Überstand verwerfen und das Pellet kurz im Speed-Vak trocknen. Die Proben nach Zentrifugation zur Bildung eines Pellets in einem denaturierenden Proteinextraktionspuffer lösen, den Überstand sammeln und den Proteinüberstand messen sowie die Protein-Konzentration gemäß Herstelleranleitung bestimmen. Für jeden der sechs Massentags mit 100 Mikrogramm Proteinprobe beginnen, wobei ein gleiches Volumen frisch zubereiteten, 200 Millimolar IO-Acetylamid-Alkylierungspuffers zugegeben wird, um die freien Thiolgruppen zu blockieren. Eine Stunde bei 37 Grad Celsius inkubieren. Um die Proteine auszufällen, ein Milliliter kalte, 80 %ige Acetonlösung zugeben und über Nacht bei minus 20 Grad Celsius lagern.

Das Protein durch Zentrifugation pelletieren und dreimal mit 80 % Aceton waschen. Nach dem Lufttrocknen der Proben auf Eis das Pellet in 50 Mikroliter Lysepuffer resuspendieren. Anschließend zur Reduktion der Disulfidbrücken 0,5 Mikroliter 100 Millimolar TCEP hinzufügen und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.

Lösen Sie die Tags auf, indem Sie 20 Mikroliter Acetonitril zu den Reagenzröhren hinzufügen. Vortexen und kurz zentrifugieren, um überschüssiges TCEP zu entfernen. Geben Sie 50 Mikroliter Probe auf eine MicroCon-3-KD-Säule. Fügen Sie 50 Mikroliter Lysepuffer hinzu und zentrifugieren Sie 15 Minuten bei 10.000 × g und 4 °C.

Um die Probe zu sammeln, entfernen Sie die Säule, drehen sie auf einen sauberen Probengefäß um und zentrifugieren Sie. Überprüfen Sie gegebenenfalls den pH-Wert der Probe. Stellen Sie den pH-Wert zwischen sieben und acht mit einmolarer Salzsäure ein.

Fügen Sie fünf Mikroliter des cyst-TMT-Reagenz hinzu und inkubieren Sie die Reaktion zwei Stunden bei Raumtemperatur. Kombinieren Sie die Proben und geben Sie ein äquivalentes Volumen an Laemmli-Puffer zu, erhitzen Sie fünf Minuten und trennen Sie die Proben auf einem vorgefertigten 12 %igen Polyacrylamidgel. Spülen Sie das Gel dreimal mit filtriertem Wasser, färben Sie es eine Stunde lang mit Coomassie-Blau und entfärben Sie über Nacht in Wasser, basierend auf der Proteinkonzentration der Banden. Teilen Sie jeweils 12 Fraktionen pro Gelbahn auf. Schneiden Sie jede Fraktion in ein Millimeter große Stücke und geben Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Die Gelstücke vollständig mit 0,1 molarer Ammoniumbicarbonatlösung in 50 % Acetonitril ansäuern. Danach die Stücke mit 100 % Acetonitril bedecken und 15 Minuten einwirken lassen. Die Flüssigkeit abnehmen und die Stücke im Speed-Vakuum trocknen.

Fügen Sie anschließend ein gleiches Volumen an Trypsin-Lösung hinzu und stellen Sie zur Rehydratisierung auf Eis. Inkubieren Sie dann 12 bis 16 Stunden bei 37 Grad Celsius zur Trypsinverdauung. Entfernen Sie danach den flüssigen Proteinauszug aus den inkubierten Proben.

Stoppen Sie die Reaktion und entfernen Sie verbleibende Proteinverdauungsprodukte, indem Sie die Gelstücke mit 5 % Ameisensäure, 50 % Acetonitril bedecken. Schütteln Sie die Gelstücke anschließend 20 Minuten bei Raumtemperatur. Übertragen Sie das Überstand nach zwei weiteren Extraktionen in die Röhrchen mit den extrahierten Proteinen.

Trocknen Sie die Proben in 0,5-Milliliter-Röhrchen unter Vakuum. Bereiten Sie eine 50 %ige Suspension von Anti-TMT-Harz in TBS mit einer Konzentration vor, die proportional zur Intensität des jeweiligen Proteinbands ist. Waschen Sie das Harz dreimal mit einem Säulenvolumen 1× TBS und geben Sie anschließend 200 Mikroliter TBS zu jeder Probe hinzu.

Anschließend auf Anti-TMT-Harz überführen und zwei Stunden bei Raumtemperatur schütteln, gefolgt von einer Übernacht-Rotation bei vier Grad Celsius. Jede Probe auf eine Säule laden. Säulenspülungen mit jeweils 200 Mikrolitern durchführen.

Anschließend jede Probe dreimal mit 200 Mikroliter 50 %iger Elutionspuffer eluieren und im Vakuum trocknen. Danach die Proben in 12 Mikroliter 3 %iger Acetonitril-Lösung mit 0,1 % Ameisensäure resuspendieren und jeweils 5 Mikroliter direkt auf eine HPLC-Säule injizieren. Die Peptide mittels eines steigenden Acetonitril-Gradienten eluieren, wie im begleitenden Text beschrieben.

Verwenden Sie die Massenspektrometrie, um Peptide in einem Top-Zwei-durch-drei-Workflow nachzuweisen. Beginnen Sie mit einer einzelnen MS-Stufe. Erwerben Sie dann drei MS/MS-Spektren mit Fragmentierung durch höhere Energieniveaus mittels C-trapped Dissociation, gefolgt von drei weiteren.

MS mit kollisionsinduzierter Dissoziation zur Proteinidentifizierung. Analysieren Sie die Massenspektrometriedaten mithilfe eines verzweigten Workflows. Setzen Sie einen Reporter-Ionen-Quantifizierer ein, um das Verhältnis zu bestimmen.

Verarbeiten Sie außerdem das MSM-MS-Spektrum mithilfe der Knoten Spektrum-Selektor, Spektrum-Normalisierer und Spektrum-Gruppierer und führen Sie eine Datenabfrage über die Suchmaschine Seaquest durch. Dieses Bild zeigt Beispiele für ein kontrolliertes Tomatenblatt links und ein mit Pseudomonas inoculiertes Blatt rechts, nachdem die Blätter mit DAB angefärbt wurden. Das DES-Färbeprotokoll ermöglicht es, mithilfe der histochemischen Färbung Anzeichen reaktiver Sauerstoffspezies im Blattgewebe sichtbar zu machen.

Wie erwartet zeigt die Kontrolle keine signifikante Färbung, während die mit Pseudomonas behandelten Blätter positiv auf die Produktion von Wasserstoffperoxid gefärbt sind. Dieses Beispiel zeigt die Proteom-Entdeckungsdatenausgabe eines differenziell redox-regulierten Protein-Peakbereichs für jede Probe, was eine absolute Quantifizierung ermöglicht. Der Peakbereich zwischen Kontroll- und inoculierten Proben zeigt relative Mengenverhältnisse an.

Hier ist die Redoxregulation eines Proteins zwischen einer Kontroll- und einer inoculierten Probe ähnlich. Spitzen ähnlicher Intensität deuten auf das Vorhandensein von Disulfidbindungen hin, die nicht durch eine Änderung der Behandlung reguliert werden. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb einer Woche korrekt durchgeführt werden.

Denken Sie daran, die Proben kühl zu lagern und die Etiketten geordnet zu halten. Beachten Sie außerdem Sicherheitsvorkehrungen beim Umgang mit Phenol, wie zum Beispiel nag-Handschuhe zu tragen und im Abzug zu arbeiten, gemäß diesem Verfahren. Weitere Maßnahmen, wie spezifische Massenspektrometrie-Analysen von posttranslationalen Modifikationen, können durchgeführt werden, um andere Systemmodifikationen wie onige Säure und Glutenstimulation zu bestimmen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die DIB-Stand-CTMD-Aktivierung und die Redox-16-Qualifizierung durchführt.