Die Messung der Biegesteifigkeit von Bakterienzellen mit einer optischen Falle

Um die Biegesteifigkeit einzelner coli-Zellen zu bestimmen, züchten Sie zunächst die Bakterien in die exponentielle Phase und heften Sie sie dann an eine chemisch behandelte Deckglasoberfläche. Lassen Sie die bereits an der Oberfläche angehefteten Zellen weiterwachsen, sodass sie flexible Enden ausbilden. Danach leiten Sie dielektrische Kügelchen ein, fangen ein Kügelchen ein und biegen es an die flexible Zellspitze heran.

Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Zelle mit der optischen Falle zu verbiegen und die resultierenden Kraft-Weg-Daten zu messen. Die Biegesteifigkeit der Zelle kann durch eine lineare Anpassung an die Kraft-Weg-Daten berechnet werden. Hallo, ich bin Steven Wong aus dem Labor von Professor Joshua Shere am Louis-Sickler-Institut für Integrative Genomik und der Abteilung für Physik an der Princeton University.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Verbiegung einzelner Bakterienzellen und zur Bestimmung der Zellsteifigkeit. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um den Beitrag verschiedener intrazellulärer Strukturen zur mechanischen Stabilität von Bakterienzellen zu untersuchen. Beginnen wir also.

Um dieses Verfahren zu beginnen, züchten Sie drei Milliliter beliebiger E. coli-Zellen in LB-Medium bis zur exponentiellen Phase. Sobald die Zellen eine optische Dichte bei 600 Nanometern zwischen 0,2 und 0,4 erreicht haben, geben Sie dem Kulturmedium 50 Mikrogramm pro Milliliter Cephalexin für 15 Minuten zu, um ein fadenförmiges Wachstum zu induzieren. Während dieser 15 Minuten stellen Sie eine Flusskammer her.

Befestigen Sie zwei Stücke doppelseitiges Klebeband mit einem Abstand von drei Millimetern zueinander auf einem Objektträger und kleben Sie eine Deckglasplatte darauf. Der Spalt zwischen den Klebebandstücken bildet einen Kanal für fließende Flüssigkeit. Beschichten Sie das Deckglas mit PEI, indem Sie 10 Mikroliter einer 1 %igen Polyethalin-Lösung, die in Wasser verdünnt ist, mit einer Mikropipette in die Flusskammer einleiten und fünf Minuten lang inkubieren.

Anschließend waschen, indem man an einem Ende der Kammer 200 Mikroliter Wasser zuführt und am anderen Ende mit Vakuum auffängt. Nach 15 Minuten Wachstum der Bakterien in Gegenwart von Cephalexin eine Milliliter Zellkultur in einer Mikrozentrifuge abzentrifugieren und in 200 Mikroliter LV mit Cephalexin resuspendieren. Danach erneut einen Mikropipettierer an einem Ende und Vakuum am anderen Ende verwenden, um 50 Mikroliter der konzentrierten Zellkultur in die Kammer mit dem beschichteten Deckglas zu leiten, und drei Minuten lang inkubieren.

Anschließend mit 50 Mikrolitern Vel B, ergänzt mit Cephalexin, waschen. Um nicht angeheftete Zellen zu entfernen, die Kammer bei 37 Grad Celsius 30 Minuten bis eine Stunde lang inkubieren, damit sich die angehefteten Zellen vermehren können, bevor sie während der Inkubation auf das optische Fanginstrument gebracht werden. Polylysin-beschichtete Kügelchen durch Inkubation von drei Mikrolitern Polystyrolkügelchen mit einem Durchmesser von 0,5 Mikrometern in einer 0,1-%-Polylysin-Lösung, die in Wasser verdünnt wurde, für 30 Minuten herstellen.

Wenn die Inkubation der Kügelchen abgeschlossen ist, waschen Sie diese dreimal, indem Sie sie in einer Mikrozentrifuge abzentrifugieren und in einem Milliliter Wasser resuspendieren. Fahren Sie dann fort, indem Sie die Kügelchen an die Bakterien binden lassen und die Biegesteifigkeit der Zellen messen. Der schwierigste Aspekt dieses Protokolls besteht darin, eine geeignete Zelle für die Messung der Biegesteifigkeit finden, erneut lokalisieren und erkennen zu können. Eine geeignete Zelle weist ein klar definiertes befestigtes Ende und ein freies Ende auf.

Suchen Sie im Mikroskop den Flusskammer nach einer Zelle mit einem gut definierten, festen Ende. Einige Zellen sind nur an einer Spitze befestigt, und die Biegekraft an der anderen Spitze führt dazu, dass sich die gesamte Zelle dreht, anstatt sich zu verbiegen. Um eine geeignete Zelle zu finden, biegen Sie jede Zelle schnell mit der Falle, indem Sie die bewegliche Stufe über den Joystick steuern.

Wenn eine geeignete Zelle gefunden wurde, verdünnen Sie die Perlenlösung im Verhältnis 1:2 in LB mit Cephalexin, geben 30 Mikroliter der Perlenlösung in die Durchflusskammer, indem Sie sie an einem Ende pipettieren und am anderen Ende vorsichtig mit einem Kim-Wipe-Tuch abfließen lassen. Fangen Sie eine frei schwebende Perle mit einer optischen Falle ein und berühren Sie damit die freie Spitze einer Zelle. Spülen Sie die Kammer erneut mit einer Mikropipette und einem Kim-White-Tuch mit 50 Mikrolitern Cephalexin in LB aus, um nicht gebundene Perlen zu entfernen. Führen Sie anschließend ein benutzerdefiniertes, in LabVIEW geschriebenes Programm aus, um Biegekräfte an die Zelle anzulegen und die Kraft-Dehnungs-Daten aufzuzeichnen.

Zunächst kalibrieren Sie die Detektorantwort, indem Sie die befestigte Perle innerhalb des Detektionslaserstrahls mit einer RA-Abtastung scannen und die 3D-PSD-Spannungssignale aufzeichnen. Anschließend identifizieren Sie die Längsachse der Zelle in einem Mikroskopbild. Nach der Bestimmung der langen Zellachse bewegen Sie die Zelle schrittweise in einer Richtung senkrecht zur Längsachse, während Sie die zurückgelegte Distanz und die Verschiebung der Perle vom Zentrum der optischen Falle aufzeichnen.

Konvertieren Sie abschließend die Verschiebungswerte mithilfe der zuvor gemessenen Fallensteifigkeit in die aufgebrachte Kraft und speichern Sie diese. Die hier in die Datei geschriebenen Werte für Spitzenverschiebung und Kraft stellen Kraft-Verschiebungs-Daten für eine einzelne Zelle dar. Die Steigung dieser Geraden entspricht der Biegesteifigkeit der Zelle.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man die Biegesteifigkeit von E. coli mit einer optischen Falle kombiniert. Bei Verwendung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, eine geeignete Zelle mit einem klar definierten festen und einem freien Ende zu finden. Das war's.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.