Recording Multizelluläre Behavior in Myxococcus xanthus Biofilme mit Zeitraffer-Microcinematography

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, eine kostengünstige Zeitraffermikroskopie-Methode zu entwickeln, die streng genug ist, um reproduzierbare und quantifizierbare Ergebnisse zu erzielen. Dies wird erreicht, indem kostengünstige, wiederverwendbare Silikon-Dichtungen verwendet werden, um Agar-Medienplatten oder Mikroskoppräparate herzustellen. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Plattenkombinationen über eine Vielzahl von Medientypen und Agarkonzentrationen hinweg mehr als eine Woche lang ausreichend befeuchtet und belüftet bleiben.

Außerdem beschleunigt die Verwendung von acht kostengünstigen Mikroskopen die Datenerfassung, da die Zeitraffermikrofilmaufnahme ein langsamer Prozess ist. Hallo, ich bin Ryan Taylor aus dem Labor von Dr. Roy Welch vom Fachbereich Biologie der Syracuse University. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Herstellung von Zeitrafferaufnahmen bakterieller Biofilme in unserem Labor. Mit diesem Verfahren untersuchen wir das vielzellige Verhalten von MTI-Biofilmen.

Beginnen wir also. Um dieses Verfahren zu starten, messen Sie die Zelldichte einer Übernachtkultur von Occus sanus mit einem Klotterzähler. Übertragen Sie ein Milliliter der Kultur in ein 2,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, pelletieren, waschen und resuspendieren Sie die Bakterien in TPM-Medium, wie im begleitenden schriftlichen Protokoll beschrieben. Pipettieren und wirbeln Sie, um das Pellet vollständig erneut aufzuschwemmen, was einige Zeit in Anspruch nehmen kann. Fügen Sie anschließend 0,5 Gramm Aros zu 50 Milliliter TPM hinzu, dem Assay-Medium.

Fügen Sie außerdem 0,5 Gramm Aros zu 50 Millilitern C-T-T-Y-E hinzu, dem Nährbodenmedium, das zur Sterilisation autoklaviert wird. Anschließend halten Sie das Medium bei 55 Grad Celsius in einem Inkubator oder Wasserbad. Während Sie den Nachweistest aufbauen.

Die Plattenkomplexe werden weiterverarbeitet, um zuerst die nährende Scheibe unter Verwendung des flammensterilisierten Glasmikroskops herzustellen. Legen Sie eine sterile Silikonkautschukdichtung mit einer Dicke von 0,5 Millimetern auf den Objektträger. Pipettieren Sie etwa 300 Mikroliter C TT YE-Medium in die durch die Dichtung auf dem Objektträger gebildete Vertiefung.

Das C-T-T-Y-E-Agar sollte aufgehäuft werden, um Flammen zu sterilisieren; danach eine weitere Objektträgerplatte nehmen und sie in einem Winkel auf das C-T-T-Y-E-Agar legen. Das vorsichtige Ablegen des Objektträgers in einem Winkel verhindert die Bildung von Blasen. Sobald der Objektträger richtig positioniert ist, fixieren Sie das Ganze mit kleinen Büroklammern, jeweils eine auf jeder Seite.

Stellen Sie den präparierten Komplex bei vier Grad Celsius ab und lassen Sie das C-T-T-Y-E-Medien-Agro erstarren. Dies dauert gewöhnlich etwa fünf Minuten. Sobald das Agro erstarrt ist, können die Plattenkomplexe, die im Tracking-Assay verwendet werden, vorbereitet werden.

Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Objektträger zur Herstellung der Assay-Komplexe. Für jeden Komplex zwei Glasobjektträger mit der Flamme sterilisieren. Einen Autoklavgummi auf einen der Objektträger legen, um den Boden des Assays zu bilden.

Die andere Objektträgerplatte dient zum Andrücken der Agarose und als Trägerplatte. Oben auf dem Test wird ein Deckglas platziert. Wickeln Sie zunächst ein Etikettierband um einen Objektträger, sterilisieren Sie dann das Glasdeckglas durch Ausglühen und legen Sie es auf den umwickelten, sterilisierten Objektträger.

Schieben Sie die umwickelten Halterungen nach oben, um die Deckglasabdeckung zu stützen und zu verhindern, dass sie bricht. Legen Sie eine Autoklavierdichtung mit einer Pinzette auf das mit der Flamme sterilisierte Deckglas. Drücken Sie auf die Dichtungen an der unteren Folie und das Deckglas, um sicherzustellen, dass sie eine Abdichtung mit dem Glas bilden.

Andernfalls können die Medienagars austrocknen. Stellen Sie die Objektträger-Dichtung und die Abdeckung-Dichtung mit den sterilisierten Seiten nach oben beiseite und arbeiten Sie von nun an immer nur an einem Komplex gleichzeitig, um zu verhindern, dass die Medienagars erstarren, was zu einer schlechten Bildqualität führen würde. Beginnen Sie damit, die Nährscheibe zu platzieren.

Entfernen Sie den nutritiven Diskus-Komplex von vier Grad Celsius. Entfernen Sie die Bindungseclipse und heben Sie die Objektträger vorsichtig an, um die nun erstarrten C-T-T-Y-E-Aros freizulegen, und verwenden Sie dazu eine Mikroprobenpipette mit einer 100-Mikroliter-Glas-Einwegspitze. Entnehmen Sie außerdem einen nutritiven Diskus mit einem Durchmesser von einem Millimeter aus dem C-T-T-Y-E-Medium-Agar und legen Sie ihn in die durch die Dichtung auf dem Deckglas erzeugte Vertiefung.

Danach das TPM-Medienagros aus dem Inkubator entnehmen und 300 Mikroliter in den durch die Dichtung auf dem Deckglas gebildeten Brunnen pipettieren, der die Nährscheibe enthält. Das TPM-Medienagros sollte sich aufwölben, um das T-P-M-S-A-Medienagros zu ebnen. Eines der flammensterilisierten Objektträger ohne Dichtung in einem Winkel auf das TPM-Medienagros legen. Das Platzieren des Objektträgers in einem Winkel hilft, die Bildung von Blasen zu verhindern.

Befestigen Sie den Komplex mit je einer kleinen Büroklammer auf jeder Seite. Stellen Sie den geklammerten Komplex bei vier Grad Celsius ab und lassen Sie das Kulturmedium erstarren. Dies dauert normalerweise etwa fünf Minuten.

Sobald das Medium erstarrt ist, entfernen Sie den Komplex aus vier Grad Celsius. Entfernen Sie die Büroklammern und drücken Sie das Ende des Komplexes zusammen. Um den mit Klebeband umwickelten Objektträger zu lösen, nehmen Sie diesen ab und legen Sie ihn zur weiteren Verwendung auf den Arbeitsplatz.

Dann mit einer Pinzette als Keil verwenden. Das Deckglas-Dichtungsmedium-Agros-Komplex von dem Trägerobjektträger trennen und den Trägerobjektträger entsorgen. Keine Hebelbewegung verwenden, um das Deckglas-Dichtungskomplex zu trennen, da dies zum Brechen des Deckglases und/oder zum Anhaften des Medienarrays an dem Trägerobjektträger führen könnte.

Nachdem die Stützplatte entfernt wurde, das Deckglas-Dichtungs-Medium-Array-Komplex mit der Dichtungsseite nach oben auf den mit Klebeband umwickelten Objektträger legen. Dieses Komplex neben einen Brenner stellen, damit die gesamte sichtbare Feuchtigkeit von der neu freigelegten Agaroseoberfläche des Mediums verdunsten kann. Das Medium darf nicht länger als eine Minute austrocknen.

Da dies das Schwarmverhalten von M Zant beeinflussen könnte, fahren Sie fort, die Zellen auf dem frisch präparierten Assay-Komplex zu platzieren. Sobald die überschüssige Feuchtigkeit aus dem Deckglas-Dichtungsmittel-Media-Agros-Komplex verdunstet ist, aspirieren Sie 0,5 Mikroliter der konzentrierten Zellen, um sie auf das Medium aufzutragen. Drücken Sie die Pipettenspitze mit Aeros nieder, bevor Sie sich dem Media-Agros nähern.

Ein Tropfen mit Zellen erscheint an der Spitze der Pipette, wodurch es leichter ist, die Zellen abzugeben, ohne dass die Spitze das Agar-Medium berührt. Eine Vertiefung auf der Agar-Oberfläche kann das Verhalten des MZ-Schwarmes verändern. Bewegen Sie die Pipette gerade nach unten, um die Zellen etwa einen Millimeter vom eingebetteten nährenden Plättchen entfernt abzugeben.

Ziehen Sie die Pipette dann gerade wieder nach oben. Auf diese Weise stellt man sicher, dass der Schwarm kreisförmig ist. Sobald die Zellen aufgetragen sind, stellen Sie das Präparat neben den Brenner, um die Zellenstelle nicht länger als 20 Sekunden trocknen zu lassen.

Nach dem Trocknen die Objektträger-Dichtungsanordnung, die die Unterseite des Komplexes bildet, mit der Dichtung auf der Abdeckung ausrichten. Die Dichtung mit dem Zellkulturmedium über dem Zellkomplex, die die Oberseite des Komplexes bildet, vorsichtig aufschieben. Sanft zusammendrücken, um eine Abdichtung zu erzeugen.

Reinigen Sie die Oberflächen des Objektträgers unter dem Deckglas mit einem Kim-Wisch, um Rückstände zu entfernen und Kondensation zu verhindern. Platzieren Sie den Objektträger-Deckglas-Komplex unmittelbar nach der Reinigung auf dem beheizten Mikroskopständer, wobei der Objektträger unten und das Deckglas oben liegt. Falls sich Kondensation gebildet hat, lassen Sie den Objektträger-Deckglas-Komplex mehrere Sekunden auf dem beheizten Ständer stehen, bevor Sie die Bildaufnahmesoftware starten.

Um den Film vorzubereiten, wählen Sie das geeignete Objektiv am Mikroskop aus, entweder 2x, 4x oder 10x. Schalten Sie die Kamera und das Mikroskop ein und überprüfen Sie die Lichtintensität, um sicherzustellen, dass das Licht nicht zu stark ist. Schalten Sie den Computer ein und öffnen Sie das Bildaufnahmeprogramm.

Klicken Sie auf das Live-Bildfenster und fokussieren Sie das Mikroskop. Das Bild erscheint ähnlich wie das hier gezeigte. Beginnen Sie mit der Aufnahme von Bildern.

Stellen Sie sicher, dass Sie während der ersten Stunde regelmäßig die Fokussierung überprüfen, da sich das Mediumsagar absetzt und dies eine Fokusdrift verursachen kann. Sobald die Bildaufnahme abgeschlossen ist, übertragen Sie die aufgenommenen Bilder zur Speicherung. Zerlegen Sie den Objektträgerkomplex, indem Sie ihn über Nacht in 90 % Ethanol einweichen, oder behandeln Sie die Dichtungen mit TOLA, um sie wiederverwenden zu können.

Dieser Zeitrafferfilm zeigt em, die dem hier beschriebenen Nachweistest unterzogen wurden. Die Aufnahmerate beträgt ein Bild pro Minute bei einer Vergrößerung von 20x; die Wiedergabegeschwindigkeit beträgt 60 Bilder pro Sekunde. Dieser Zeitrafferfilm zeigt eine Population von eant-Zellen, wobei 1 % der Zellen GFP exprimieren.

Der Film wurde durch die Zusammenführung abwechselnder Phasenkontrast- und Fluoreszenzbilder erstellt. Der Assay wurde an C-T-T-Y-E in 1 % Aros mit einer Aufnahmerate von einem Bild pro Minute bei einer Vergrößerung von 100 x durchgeführt. Dieser Zeitrafferfilm zeigt die Gleitmotilität von M Anthes.

Dieser Test wurde an C-T-T-Y-E in 1 % Aros durchgeführt, wobei die Aufnahmerate ein Bild pro Minute bei einer Vergrößerung von 100 x beträgt. Dieser Zeitrafferfilm zeigt die P OSA-Zuckungsbeweglichkeit. Dieser Test wurde auf LB in 1 % Aros durchgeführt, wobei die Aufnahmerate ein Bild pro Minute beträgt.

Bei einer Vergrößerung von 20× beträgt die Wiedergabegeschwindigkeit 60 Bilder pro Sekunde. Dieser Zeitrafferfilm zeigt, dass Smar Schwarmbeweglichkeit aufweist. Der Assay wurde auf LB und 1 % Agar durchgeführt, wobei die Aufnahmerate ein Bild pro Minute betrug.

Bei einer Vergrößerung von 20× beträgt die Wiedergabegeschwindigkeit 60 Bilder pro Sekunde. Dieses Zeitraffervideo zeigt die Gleitmotilität von EGT. Dieser Test wurde auf LB mit 0,5 % Tag durchgeführt. Die Aufzeichnungsrate beträgt ein Bild pro Minute, bei einer Vergrößerung von 20× und einer Wiedergabegeschwindigkeit von 120 Bildern pro Sekunde aufgrund der Empfindlichkeit von 0,5 % arose in lv.

Dieser Test verwendet die größeren Dichtungen, die in Abbildung eins B zu sehen sind. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man Zeitrafferaufnahmen von bakteriellen Biofilmen erstellt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich Zeit zu nehmen und so präzise wie möglich vorzugehen, um konsistente Ergebnisse zu erzielen.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.