Chronische Imaging of Mouse Visual Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

Dendritische Dornfortsätze sind membranöse Ausstülpungen aus dem Dendriten eines Neurons, die synaptische Eingaben empfangen. Eine Verlängerung, Verkleinerung, das Auftreten oder Verschwinden von Dornfortsätzen tritt als Reaktion auf Veränderungen der neuronalen Netzwerkfunktion auf, die sich aus bestimmten Mustern neuronaler Aktivität ergeben. Dieses Phänomen ist als kortikale Plastizität bekannt, um morphologische Veränderungen an dendritischen Dornfortsätzen zu beobachten.

Bei lebenden Tieren wird eine Bildgebungsplatte am Schädel einer Maus befestigt. Ein Bereich des Schädels wird chirurgisch ausgedünnt und Aufnahmen mit niedriger und hoher Vergrößerung werden angefertigt. Dieselben Bereiche werden zu späteren Zeitpunkten erneut abgebildet.

Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die Morphologie dendritischer Dornen mittels einer dünnen Schädelpräparation zu mehreren Zeitpunkten klar visualisiert werden kann. Außerdem zeigt sich, dass die Dornmorphologie hochplastisch ist und strukturelle Veränderungen sowie das Auftreten und Verschwinden dendritischer Dornen aufweist. Hallo, ich bin Emily Kelly im Labor von Anaya Maka am Department für Neurobiologie und Anatomie der Universität von Rochester.

Heute zeigen wir Ihnen die Vorgehensweise für die chronische Bildgebung der Maus-Vial-Rinde nach einer als Präparation bezeichneten Methode. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um den Umsatz dendritischer Dornen zu untersuchen. Beginnen wir also.

Beginnen Sie das Verfahren mit der Sterilisation der Instrumente für eine aseptische Operation. Anschließend sterilisieren Sie den Arbeitsbereich mit 70 % Ethanol und bedecken die Operationsfläche mit sauberem Verbandsmaterial. Überwachen Sie die Anästhesietiefe bei einer mit einem Fentanyl-Cocktail anästhesierten Maus, indem Sie die Reaktion auf einen Zehenquetschtest überprüfen; die hier gezeigte Maus ist eine A-G-F-P-M-transgene Maus, in der GFP exprimiert wird.

In der Schicht fünf parametale Zellen, die dendritische Fortsätze in die oberflächlichen Schichten projizieren. Um eine Körpertemperatur von 37,5 Grad Celsius aufrechtzuerhalten, stelle das Tier auf eine Heizdecke und überwache es mit einem angeschlossenen Rektalthermometer. Anschließend trage mit einer Schere Augensalbe auf die Augen auf, um Austrocknung zu verhindern.

Entfernen Sie die Haare am Hinterkopf der Maus von hinter den Ohren bis zu den Augen. Reinigen Sie dann die Kopfoberseite des Tieres mit einer Applikation von 70 %igem Ethanol, gefolgt von einer Betadine-Behandlung mit Tupfer und Betadine-Lösung. Führen Sie einen LCU-Schnitt hinter den Ohren und entlang der rechten oder linken Seite der Mittellinie bis zu den Augen durch, je nachdem, welches Hemisphäre abgebildet werden soll, und klappen Sie die Haut über die Operationsstelle weg.

Entfernen Sie die Haut nicht, da sie später mit feinen Pinzetten genäht wird. Ziehen Sie die Haut vorsichtig nach oben und weg von der interessierenden Region. Verwenden Sie saubere Pinzetten, um das Periost vorsichtig von dem freigelegten Bereich des Schädels abzukratzen.

Tragen Sie eine kleine Menge von 10 % Eisen(III)-chlorid auf den Schädel auf, um die Periostmembran vollständig zu trocknen und sicherzustellen, dass sie vollständig entfernt wurde. Es ist wichtig, dass der Schädel vollständig trocken ist. Um eine ordnungsgemäße Haftung des Klebstoffs zu gewährleisten, kratzen Sie vorsichtig getrocknete Reste der Periostmembran mit einer mikrochirurgischen Klinge ab.

Als Nächstes tragen Sie eine dünne Schicht Sano-Acrylkleber um das Bildfenster der Edelstahlhalterungsplatte auf und befestigen die Platte am Schädel. Mit dem Holzende eines Wattestäbchens tragen Sie Kleber auf die Innennähte des Bildfensters auf, wobei Sie sicherstellen, dass alle Spalten zwischen der Bildplatte und der Krümmung des Schädels ausgefüllt sind. Geben Sie einen Tropfen des Kleber-Härtemittels in das Fenster.

Danach schnell den Überschuss abwischen. Die Klebstoffbindung vollständig trocknen lassen. Mit einem Zahnarztbohrer, der mit einer 0,7-Millimeter-Stahlfräse ausgestattet ist, beginnen Sie, den Schädel im Bildgebungsfenster auszudünnen.

Wechseln Sie das Bohren mit gelegentlicher Anwendung von 0,9 % steriler Kochsalzlösung ab, um übermäßige Wärmeentwicklung am Schädel zu vermeiden. Dünner ein vier mal vier Millimeter großes Fenster am Schädel durch kleine Striche über die Schädeloberfläche.

Verwenden Sie den Zahnbohrer. Prüfen Sie die Dicke des Schädels mit einer stumpfen Pinzette. Die Schädeloberfläche wird sich bei leichtem Druck leicht eindellen.

Die optimale Schädeldicke für die Bildgebung liegt zwischen 10 und 30 Mikrometern. Nachdem der Schädel ausgedünnt wurde, säubern Sie das Fenster vollständig von Rückständen und geben Sie physiologische Kochsalzlösung auf den Schädel. Fotografieren Sie das Bildgebungs-Fenster mit einer an ein Stereomikroskop montierten Digitalkamera.

Die Gehirngefäße auf diesem Foto helfen dabei, die Position für die Platzierung der Bildgebungsplatte bei nachfolgenden Bildgebungssitzungen zu bestimmen. Transportieren Sie das Tier zum Zwei-Photonen-System. Das Tier sollte weiterhin auf der Heizdecke liegen, und die Körpertemperatur sollte während der gesamten Bildgebungssitzung kontinuierlich überwacht werden.

Ein Zwei-Photonen-Mikroskop mit einem Mi-Tai-Laser. Es wird eine 10-Watt-Festkörperlaserpumpe für maximale Leistung und eine modifizierte Olympus-Flow-View-Konfokaleinheit verwendet. Das System ist für die Bildgebung tiefer Gewebeschichten optimiert, und externe Detektoren sind so nah wie möglich am Objektiv installiert, um eine maximale Detektion der Fluoreszenz aus dem Gehirn zu ermöglichen; geben Sie einen Tropfen Salzlösung auf das Bildgebungs-Fenster, indem Sie eine niedrige digitale Vergrößerung verwenden.

Identifizieren Sie mithilfe einer am Mikroskop befestigten Digitalkamera einen Bereich mit stark gefärbten Neuronen. Ips, machen Sie eine Aufnahme des Abbildungsbereichs. Dies ist erforderlich, um zu einem späteren Zeitpunkt zur gleichen Abbildungsposition zurückzukehren.

Erhalten Sie einen Low-Magnification-Stack über die gesamte sichtbare Ausdehnung des Gehirns, der das Ausmaß der dendritischen Verzweigung zeigt. Dieser wird verwendet, um den Bildgebungsarea zu späteren Zeitpunkten zu lokalisieren, sowohl anhand der Blutgefäße als auch der Dendriten. Bewahren Sie deren Struktur bei jungen und erwachsenen Tieren mithilfe von Bildgebungssoftware auf.

Erhöhen Sie die digitale Vergrößerung achtfach, passen Sie gegebenenfalls die XY-Koordinaten an und erfassen Sie einen Stapel mit hoher Vergrößerung, der eine detaillierte dendritische Morphologie einschließlich der Lage und Struktur dendritischer Dornen zeigt. Machen Sie detaillierte Notizen zu jeder Stapelerfassung, einschließlich Pan-Koordinaten, Erfassungsbereich, Z-Schrittgröße und Anzahl der Schritte im Stapel. Diese Notizen werden verwendet, wenn zu einem späteren Zeitpunkt zu diesem Dendrit oder Axon zurückgekehrt wird.

Nach der Bildgebung entfernen Sie die Kopfplatte, indem Sie sie vorsichtig von der Schädeloberfläche lösen. Verwenden Sie dazu Pinzette. Entfernen Sie eventuell verbliebene Klebereste und wischen Sie den Schädel mit 0,9 % steriler Kochsalzlösung ab.

Nähen Sie die Haut über dem Schädel mit Sechser-Nahtfaden zusammen. Wischen Sie den Bereich nach dem Bildgebungsverfahren mit 70 %igem Ethanol ab. Stellen Sie das Tier in einen sauberen Käfig unter eine Wärmelampe, bis es aufwacht und beweglich ist.

Bringen Sie das Tier dann in seinen ursprünglichen Käfig zurück, um es zu einem späteren Zeitpunkt – zwischen zwei Tagen und mehreren Monaten – erneut abzubilden. Entfernen Sie die Nähte und öffnen Sie die Haut am Kopf erneut. Nutzen Sie unter aseptischen Bedingungen das digitale Bild der Hirngefäße, das während der ersten Operation aufgenommen wurde, um die ursprüngliche Bildgebungslage zu lokalisieren. Befestigen Sie dann die Kopfplatte erneut wie zuvor.

Verwenden Sie eine mikrochirurgische Klinge, um gegebenenfalls vorsichtig Knochen abzutragen, der sich zwischen den Bildgebungszeitpunkten möglicherweise wieder gebildet hat. Dünne mit einem Zahnbohrer ab, reinigen Sie das Bildgebungs-Fenster von Ablagerungen und geben Sie einen Tropfen 0,9 %iger steriler Kochsalzlösung hinzu. Bringen Sie das Tier zu einem Zwei-Photonen-Mikroskop und lokalisieren Sie den ursprünglichen Bildgebungsbereich mithilfe des digitalen fluoreszierenden Bildes, das während der vorherigen Sitzung aufgenommen wurde.

Starten Sie das Durchflussansicht-Programm. Öffnen Sie das ursprüngliche Bild mit niedriger Vergrößerung, befestigen Sie ein Transparentpapier an dem Computerbildschirm und skizzieren Sie das Hauptmuster der Blutgefäße mit einem Stift für Transparentfolien. Öffnen Sie anschließend das Live-Bild und richten Sie die Blutgefäße erneut an dem auf dem Transparentfilm skizzierten Muster aus.

Entfernen Sie die Transparentfolie, um die acht mal vergrößerten Strukturen erneut abzubilden. Öffnen Sie den gewünschten aufgenommenen Stack aus der vorherigen Bildgebungssitzung. Zeichnen Sie die Struktur auf eine am Bildschirm befestigte Transparentfolie.

Vergrößern Sie das Live-Bild um das Achtfache und richten Sie das Bild an der Transparenz aus. Abhängig von der Genauigkeit der Ausrichtung der Position bei niedriger Vergrößerung kann es notwendig sein, den Winkel des Bildes leicht anzupassen. Stellen Sie die Pan-Koordinaten auf die Bildaufnahmeparameter des ersten Tages ein, einschließlich Schrittgröße und Anzahl der aufzunehmenden Bilder. Die Wiederholung der Zack-Aufnahme kann zweimal durchgeführt werden. Die Anzahl der Öffnungen der Kopfhaut sollte begrenzt werden, um die Integrität des Schädels nicht zu beeinträchtigen, was andernfalls zu einer schlechten Bildauflösung bei GFP-Mäusen führen würde.

Ein Teilbereich von parametakortikalen Zellen der Schicht fünf und die entsprechenden dendritischen Prozesse wurde mittels in-vivo-Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie sichtbar gemacht; hier sind GFP-markierte dendritische Fortsätze des visuellen Kortex dargestellt. Diese Aufnahme ist eine Projektion einzelner Bilder, die im Abstand von jeweils fünf Mikrometern von der Pia bis zu einer endgültigen Tiefe von 175 Mikrometern aufgenommen wurden. Der markierte Bereich ist hier am Tag null in höherer Vergrößerung dargestellt und erneut am Tag vier; hier erfolgt ein Vergleich der hochvergrößerten Aufnahmen eines dendritischen Astes vom Tag null und Tag vier.

Diese Bilder zeigen stabile Dornfortsätze, die durch weiße Pfeilspitzen gekennzeichnet sind, verlorene zurückziehende Dornfortsätze, die durch rote Pfeilspitzen markiert sind, sowie neue Dornfortsätze, die durch grüne Pfeilspitzen angezeigt werden. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man eine chronische Zweiphotonen-Bildgebung in der visuellen Rinde der Maus unter Verwendung einer dünnen Schädelpräparation durchführt. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, besondere Vorsicht während des Ausdünnens walten zu lassen, um Schäden am Schädel und der darunterliegenden Dura zu vermeiden, da dies zu einer schlechten Bildauflösung führen würde, und detaillierte Notizen anzufertigen.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.