Ein Kraniotomie Chirurgie Verfahren für chronische Brain Imaging
15. Februar 2008
Dieses Video-und Protokoll zu demonstrieren, wie man ein Glas überdachten kranialen Fenster in Nagetieren zu implantieren. Diese Zubereitungen können bei chronischen in vivo Zwei-Photonen-Imaging des Neokortex über Zeitskalen von Monaten verwendet werden. Es kann auch für andere Arten der Bildgebung, darunter optische Eigensicherheit Signal Bildgebung verwendet werden.
Bildgebende Verfahren gewinnen zunehmend an Bedeutung bei der Erforschung der Gehirnfunktion. Unter ihnen hat sich die Zweiphotonen-Laser-Mikroskopie als äußerst nützliche Methode herauskristallisiert, da sie die Untersuchung des lebenden Gehirns ermöglicht und bei geeigneten Vorbereitungen durchführbar ist. Diese Technik erlaubt die chronische Beobachtung derselben kortikalen Region über Zeiträume von Minuten bis hin zu Monaten.
In diesem Video zeigen wir eine Vorbereitung für die chronische In-vivo-Bildgebung des Gehirns unter Verwendung der Zwei-Photonen-Mikroskopie. Die heute demonstrierte Schädel-Fenster-Präparation wurde ursprünglich von Dr. Carl Voda, einem Wissenschaftler des Howard Hughes Medical Institute am Janelia Farm, entwickelt. Hi und Ricardo stammen aus dem Labor von Carlos Porter Cayo aus der Abteilung für Neurologie an der University of California, Los Angeles.
Heute werden wir Ihnen das Verfahren zur Herstellung eines Schädel-Fensters für die chronische In-vivo-Bildgebung zeigen. Diese Vorbereitung ist sehr nützlich, da sie die Bildgebung in tiefen Hirnregionen mithilfe eines Zwei-Photonen-Laser-Mikroskops ermöglicht. Beginnen wir also.
Vor Beginn der Operation werden Mäuse mit Isofluran anästhesiert: 4 % zur Induktion, 1,5 bis 2 % während der Operation, unter Verwendung von von der I-A-C-U-C genehmigten Verfahren. Es ist wichtig, Schwanz- und/oder Zehenquetschungen durchzuführen, um sicherzustellen, dass das Tier vollständig sediert ist. Mithilfe eines Nagetierschermessers wird das Haar vom Nacken bis zu den Augen abrasiert.
Nach dem Rasieren wird die Maus auf einen stereotaktischen Halter gesetzt, der auf einer wiederverwendbaren Wasserdecke mit einer Temperatur von 37 Grad Celsius liegt. Der Kopf wird anschließend mithilfe von Ohrstiften fest fixiert. Danach wird Augensalbe aufgetragen, um zu verhindern, dass das Auge des Tieres austrocknet. Anschließend werden Dexamethason (0,2 Milligramm pro Kilogramm) und Carprofen (5 Milligramm pro Kilogramm) subkutan verabreicht.
Um eine Schwellung des Gehirns bzw. eine entzündliche Reaktion zu verhindern. Vor Beginn der Operation sicherstellen, dass der Operationsbereich durch Abwischen der Haut mit drei wechselnden Tupfern aus 70 %igem Alkohol und Betadine sterilisiert wird. Alle chirurgischen Instrumente wurden zuvor mit einem Glasperlen-Sterilisator sterilisiert, wobei die Scheren zuvor mit Ethanol besprüht wurden.
Die Haut über der Schädeldecke wird entfernt, beginnend mit einem horizontalen Schnitt entlang der Schädelbasis, gefolgt von zwei Schnitten in rostraler Richtung, die fast bis zu den Augenlidern reichen. Anschließend erfolgen zwei schräge Schnitte, die sich in der Mittellinie treffen. Zu diesem Zeitpunkt wird ein Tropfen Lidocain- und Adrenalinslösung auf das Periost aufgetragen, um übermäßige Blutung oder Schmerzen zu vermeiden; mit einem Skalpell wird das Periost zu den Schädelrändern zurückgeschoben.
Die Muskulatur im Nackenbereich wird ebenfalls leicht zurückgezogen. Anschließend wird die gesamte freigelegte Schädelfläche vorsichtig mit einem Skalpell abgeschabt, um eine trockene Oberfläche zu schaffen. Dies ist sehr wichtig, da dadurch der spätere Halt des Klebstoffs verbessert wird.
Nachdem ein Bildgebungsstandort gewählt wurde, kann man zunächst mit der Herstellung des kranialen Fensters beginnen. Ein Kreis mit einem Durchmesser von etwa vier Millimetern wird vorsichtig mit einem pneumatischen Zahnbohrer eingezeichnet. Nach einer leichten Bohrung wird erneut eine Lidocain-Adrenalin-Lösung auf die Schädelloberfläche aufgetragen.
Das Bohren wird gestoppt, wenn eine sehr dünne Knochenlage übrig bleibt, normalerweise eine Nasenbreite. Dieser Zustand wird erreicht, indem vorsichtig auf die Mitte der Kraniotomie gedrückt wird, um zu spüren, wie sie sich unter einem Tropfen Kochsalzlösung nachgibt, und indem die knöchernen Trabekel einer schwammartigen Knochenstruktur ausgenutzt werden.
Der Kranioschlag wird mit einer sehr dünnen Pinzette vom Schädel gelöst. Die Kochsalzlösung ist wichtig, da sie dabei hilft, den Schädel anzuheben und eine Blutung der Dura zu verhindern. Anschließend wird Gelatineschwamm, der zuvor in Kochsalzlösung getränkt wurde, auf das Dura mater aufgebracht, um geringfügige Blutungen zu stillen, die manchmal beim Entfernen des Schädels auftreten.
Nachdem die Dura-mater-Oberfläche getrocknet und sichergestellt wurde, dass keine Blutung vorliegt, wird vorsichtig ein steriler fünf Millimeter großer Glas-Deckgläser auf die Dura mater aufgelegt. Ein Tropfen Klebstoff auf Cyanoacrylat-Basis wird auf die gegenüberliegende Hemisphäre des Schädels aufgetragen. Mithilfe einer Nadel wird der Klebstoff vorsichtig rund um das Fenster verteilt, wobei darauf geachtet wird, ihn nicht unter das Glas zu bringen.
Jetzt kann ein dünner Klebefilm über die gesamte Schädelfläche aufgetragen werden. Sobald der Kleber getrocknet ist, wird Zahnacryl angerührt und auf der gesamten Schädelfläche verteilt, wobei auch ein schmaler Rand des Deckglases mitbedeckt wird, um dieses zu befestigen. Nach der Fixierung des Deckglases wird mit Zahnacryl ein kleiner Wall um das Fenster herum angelegt.
Ein Titanstab ist ebenfalls in die Zahnacrylmasse eingebettet. Dieser Stab wird später verwendet, um die Maus sicher auf der Mikroskoptischplatte zu befestigen. Für die Bildgebung ist es wichtig sicherzustellen, dass der Stab waagerecht ausgerichtet ist, sodass er parallel zu einem kranialen Fenster verläuft.
Wenn ein Stück Papier unter den Stab gelegt wird, kann der Stab während des Aushärtens des Acryls waagerecht gehalten werden. Das zahnmedizinische Acryl darf 10 Minuten lang aushärten, wodurch der Titanstab fest verankert wird. Anschließend wird das Tier in einen warmen Käfig gebracht, bis es sich erholt hat. Nach der Erholung von der Anästhesie kann das Tier am selben Tag abgebildet werden.
Dieses Video zeigt einen Stapel von 160 Bildern, die in Fünf-Mikrometer-Abständen mit unserem speziell angefertigten Zwei-Photonen-Mikroskop durch ein Schädel-Fenster über dem somatosensorischen Kortex einer dreimonatigen GFPM-Maus aufgenommen wurden. Diese transgene Mauslinie exprimiert GFP in einer kleinen Untergruppe von parvalbuminhaltigen Neuronen. In Schicht fünf und Schicht zwei drei wurde das Bild mit einem 40x-Wasser-Immersion-Objektiv mit einer numerischen Apertur von 0,8 unter Verwendung einer Anregungswellenlänge von 910 Nanometern aufgenommen.
In den oberflächlicheren Aufnahmen lassen sich die dendritischen Bäume der apikalen Dendriten der Parametazellen leicht erkennen. Die apikale Büschelstruktur der Dendriten jedes Neurons mündet in einen einzigen großen apikalen Dendriten. Kleinere seitliche Dendriten sind ebenfalls sichtbar, die von diesem Hauptapikal-Dendriten abzweigen; Axone, die das Sichtfeld kreuzen, sind ebenfalls erkennbar.
Dies ist ein Stapel von 12 Bildern, die jeweils im Abstand von eineinhalb Mikrometern mit dem gleichen 40x-Objektiv bei höherer Vergrößerung aufgenommen wurden; ein oberflächlicher Dendrit ist mit ausreichend hoher Auflösung dargestellt, um einzelne dendritische Dornen sichtbar zu machen. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man eine Überdeckung des Schädels für die chronische Bildgebung des Gehirns mittels Lichtmikroskopie präpariert. Dies ist eine äußerst leistungsfähige Methode zur Untersuchung des Gehirns, da sie es ermöglicht, sowohl die Struktur als auch die Funktion des lebenden Gehirns nicht nur bei einer einzelnen Bildaufnahme, sondern auch chronisch über mehrere Bildaufnahmen hinweg über Zeiträume von mehreren Monaten zu untersuchen.
Ein weiterer Vorteil der Schädel-Fenster-Präparation besteht darin, dass ein großes Sichtfeld abgebildet werden kann, was die Darstellung großer Strukturen wie einer gesamten Aktion oder des inri Arbor über einen Bereich von Millimetern ermöglicht. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, stets unter möglichst sauberen und sterilen Bedingungen zu arbeiten und einen sehr ruhigen Handschlag zu haben. Gut, das war’s.
Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.
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Übersicht
Dieses Video zeigt die Implantation eines glasüberdeckten Schädel-Fensters bei Nagetieren, das eine chronische in-vivo-Zwei-Photonen-Bildgebung des Neokortex über längere Zeiträume ermöglicht. Diese Technik ist entscheidend für die Beobachtung der Gehirnfunktion und kann für verschiedene Bildgebungsverfahren angepasst werden.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Bildgebende Verfahren
- In-vivo-Studien
Hintergrund
- Bildgebende Verfahren sind entscheidend für die Untersuchung der Gehirnfunktion.
- Mithilfe der Zweiphotonen-Laser-Mikroskopie lässt sich das Gehirn in vivo beobachten.
- Diese Methode ermöglicht die chronische Beobachtung kortikaler Areale.
- Die Herstellung eines Schädel-Fensters ist für diese Bildgebung unerlässlich.
Zweck der Studie
- Eine Vorbereitung für die chronische In-vivo-Bildgebung demonstrieren.
- Die Untersuchung der Gehirnfunktion über die Zeit hinweg erleichtern.
- Ein Protokoll für Forschende in der Neurowissenschaft bereitstellen.
Verwendete Methoden
- Implantation eines glasüberdeckten Schädel-Fensters.
- Zweiphotonen-Laser-Mikroskopie zur Bildgebung.
- Chronische Beobachtung der Neokortexregion.
- Zusammenarbeit mit Experten auf dem Gebiet.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Implantation des Schädel-Fensters.
- Nachweis der Möglichkeiten zur chronischen Bildgebung.
- Potenzial für verschiedene bildgebende Anwendungen.
- Beitrag zum Verständnis der Gehirnfunktion.
Schlussfolgerungen
- Die Herstellung eines Schädel-Fensters eignet sich gut für die chronische Bildgebung.
- Diese Methode verbessert die Untersuchung lebender Gehirndynamiken.
- Sie erschließt neue Möglichkeiten für zukünftige Forschung im Bereich der Neurowissenschaften.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Die chronische In-vivo-Bildgebung ermöglicht die longitudinale Beurteilung der Zielstrukturenbindung und der Signalwegmodulation in krankheitsrelevanten Systemen und unterstützt so die mechanistische Risikominderung in der frühen Entdeckungsphase. Dieser Ansatz liefert Vorhersagesicherheit, indem er strukturelle und funktionelle Messgrößen über die Zeit miteinander verknüpft und somit Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch in Arbeitsabläufen zur Zielvalidierung und Leitstrukturidentifizierung unterstützt. Die Methode verbessert die translationale Kontinuität von der Entdeckung bis hin zu präklinischen Stadien, indem sie reproduzierbare, quantitative Ergebnisse für die Portfolioauswahl bereitstellt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch langzeitliche Beobachtung der kortikalen Struktur und Funktion.
- Operationaler Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung, indem wiederholte Bildgebungssitzungen zur Beurteilung der Zielkonsistenz ermöglicht werden.
- Prädiktiver Wert: Erleichtert die Portfolio-Priorisierung, indem chronische Bildgebungsdaten über längere Zeiträume hinweg mit mechanistischen Erkenntnissen verknüpft werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für die nachgeschaltete Evaluierung von Substanzen mit stabilen Bildgebungszeitfenstern vor.
- Operationaler Wert: Gewährleistet Standardisierung und Reproduzierbarkeit des Assays durch chronischen Zugang zu demselben kortikalen Areal.
- Strategischer Wert: Ermöglicht zuverlässige Substanzscreenings, indem quantitative, zeitlich aufgelöste strukturelle und funktionelle Daten bereitgestellt werden.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die chronische Bildgebung neokortikaler Dynamiken in transgenen Modellen und ist somit an krankheitsrelevanten Systemen ausgerichtet.
- Operationaler Wert: Unterstützt die Übereinstimmung translationaler Biomarker durch chronische Überwachung struktureller und funktioneller Veränderungen.
- Prädiktiver Wert: Leitet risikoadjustierte Entscheidungen zur Weiterentwicklung ab, indem bildgebende Ergebnisse mit präklinischen Validierungsendpunkten verknüpft werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung über die Lead-Identifizierung bis hin zur präklinischen Forschung, indem sie chronische, quantitative Bildgebungsdaten bereitstellt, die Hypothesentests und die Aufklärung von Signalwegen unterstützen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und die Aufklärung von Signalwegen durch Längsschnittuntersuchungen der kortikalen Struktur und Funktion.
- Screening: Gewährleistet Bereitschaft und Reproduzierbarkeit von Assays durch stabile Schädeldeckenfenster, die wiederholte Messungen ermöglichen.
- Analytik: Erzeugt quantitative Messgrößen (z. B. dendritische Dynamik, Kalziumaktivität, Durchblutung), die einen Vergleich zwischen verschiedenen Bedingungen erlauben.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Forschung, indem chronische Beobachtungen krankheitsrelevanter struktureller und funktioneller Veränderungen ermöglicht werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Dient als wiederverwendbare Plattform für Längsschnittstudien über mehrere Projekte und Zeitpunkte hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit, Zielvalidierung und Verringerung mechanistischer Mehrdeutigkeiten durch chronische Beobachtung.
- Operationaler Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit von chronischen Bildgebungsmethoden.
- Strategischer Wert: Bessere Go/No-Go-Entscheidungen, Kapitalwirksamkeit und verringertes biologisches Risiko in späteren Phasen durch Längsschnittdaten.
- Portfolioauswirkung: Risikoadjustierte Priorisierungs- und Weiterentwicklungsentscheidungen basierend auf Ergebnissen der chronischen Bildgebung.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Mikrochirurgie, steriler Technik und In-vivo-Bildgebungsprotokollen.
- Benötigt spezialisierte Instrumente wie Zwei-Photonen-Mikroskope, stereotaktische Rahmen und Temperaturregelungssysteme.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams hinsichtlich chirurgischer Verfahren, Bildgebungsparameter und Datenanalyse-Workflows.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen für verschiedene Modellsysteme, einschließlich transgener Linien und Krankheitsmodelle.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die Abhängigkeit von der chirurgischen Fertigkeit, das potenzielle Auftreten von gliösen Narben im Zeitverlauf und die Notwendigkeit einer aseptischen Pflege zur Sicherstellung der Langlebigkeit des Fensters.
