Live Cell Reaktion auf mechanische Stimulation von Integrated Optical und Atomic Force Microscopy Studium
4. Oktober 2010
Dieses Papier soll den Leser in den Betrieb eines integrierten atomic force-optische Bildgebung Mikroskop für die mechanische Stimulation von lebenden Zellen in Kultur zu unterrichten. Eine Schritt-für-Schritt-Protokoll vorgestellt. Eine repräsentative Datenmenge, die Live-Zell-Antwort auf mechanische Stimulation zeigt vorgestellt.
Die Untersuchung der Echtzeit-Zellantwort auf mechanische Reize erfolgt, indem Zellen, die GFP-Fusionsproteine exprimieren, zunächst 24 Stunden lang auf Glasbodenschalen kultiviert werden. Im zweiten Schritt wird die AFM-Spitze mit biotinyliertem Fibronectin beschichtet. Anschließend wird die funktionalisierte AFM-Spitze mit der Zelloberfläche in Kontakt gebracht, um die Bildung einer starken fokalen Adhäsion um die AFM-Spitze zu ermöglichen, wodurch eine direkte Manipulation des Aktin-Zytoskeletts über eine Matrix-Integrin-Aktin-Verbindung zwischen der mit Fibronectin beschichteten Spitze und der Zelle möglich ist.
Der letzte Schritt besteht darin, die lebende Zelle durch eine kontrollierte Aufwärtsbewegung der AFM-Spitze mechanisch zu stimulieren, sodass die vertikale Kraft an der Stelle des Zellkontakts angewendet wird, ohne die starke fokale Adhäsion zu lösen. Letztendlich zeigen die Ergebnisse, dass Zellen auf die mechanische Stimulation reagieren, indem sie ihre Anheftung an das Substrat verstärken und eine Neuorganisation des Aktin-Zytoskeletts induzieren, wie mittels Echtzeit-Fluoreszenz-Optik-Aufnahmen dokumentiert wurde. Hallo, ich bin Andrea Trake, wissenschaftliche Assistentin am Department für Systembiologie und Translationale Medizin am Texas A&M Health Science Center.
Hallo, ich bin Sum Lim. Ich bin Postdoktorand in der Abteilung für Systembiologie und Translationale Medizin am Texas A&M Health Science Center. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Untersuchung der adaptiven zellulären Umgestaltung durch mechanische Stimulation.
Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die zytoskelettale Umstrukturierung in lebenden glatten Gefäßmuskelzellen in Echtzeit zu untersuchen. Beginnen wir also. Für diese Untersuchungen wird ein invertiertes Olympus-IX-81-Mikroskop mit einer Total-Reflexions-Fluoreszenz (TIRF)-Einheit in Kombination mit einem CSU-22-Yokogawa-Scanning-Kopf verwendet.
Ein Bio-Scope-SZ-Atomkraftmikroskop ist auf einem invertierten optischen Mikroskop montiert. Das gesamte System ist auf einem optischen Tisch für Forschungszwecke installiert und wurde bereits ausführlich beschrieben. Dieses integrierte Mikroskop verwendet zwei Quant-EM-Elektronenvervielfachungs-CCD- oder E-M-C-C-D-Kameras.
Eines dient der Rasenabbildung und das andere der konfokalen Bildgebung. Die Konfokalbaugruppe, bestehend aus dem Spinning-Disk-Scanner, einem externen Filterrad und einer E-M-C-C-D-Kamera, ist auf einer Aluminiumgrundplatte montiert, die auf einer Silikonunterlage zur Schwingungsdämpfung platziert ist. Die gesamte Konfokalbaugruppe verbindet sich über einen Flansch mit einem Gewindeflansch mit dem Mikroskop.
Daher kann die Montage während der Rasterkraftmikroskopie oder FM-Messungen von dem Mikroskop entkoppelt werden, um Vibrationen durch den rotierenden Scannerkopf zu vermeiden. Als Anregungsquelle für die TIRF- und konfokale Bildgebung dient ein Argon-Krypton-Laser. Der Laser kann mit einer der beiden optischen Fasern gekoppelt werden, die das Laserlicht entweder zur TIRF-Aufnahme oder zum konfokalen Scankopf leiten.
Zwei Computer steuern das System. Einer verwendet Slide-Book-Software, die die optische Bildgebung kontrolliert, und der andere Nano-Scope-Software, die die AFM kontrolliert. 24 Stunden vor dem mechanischen Stimulationsversuch werden lebende Zellen, die GFP-Konstrukte exprimieren, die gegen spezifische Proteine gerichtet sind, in eine Zellkulturschale mit Glasboden gegeben. Am Tag des Experiments ersetzen Sie das Zellkulturmedium durch phenolrotfreies Medium.
Da ein FM-Experiment sehr störanfällig ist, sollte während des Experiments weder gesprochen noch der optische Tisch oder das Mikroskop berührt werden, um Störungen zu minimieren. Bei den FM-Messungen muss die Spinning-Disk-Konfokalanlage vom Mikroskop entkoppelt werden. Das Experiment beginnt damit, dass die Zellkulturschale mit einem magnetischen Kragen auf der FM-Bühne befestigt wird, um die Schale auf dem magnetischen Mikroskoptisch zu fixieren.
Der V-förmige Hebel auf der AFM-Sonde ist mit einer zwei Mikrometer großen, biotinylierten Glaskugel angepasst. Der Hebel kann leicht mithilfe des Mikroskops gesehen werden. Die Kugel ist am äußersten Ende des Hebels verklebt, und genau dort sollte die Beschichtungslösung tropfenweise aufgebracht werden.
Um die FM-Sonde für das Experiment vorzubereiten, montieren Sie zunächst die Spitze in der Glasfassung und platzieren Sie anschließend die Glasfassung auf der Tischhalterung, um die Spitze zu beschichten. Spülen Sie die Spitze, indem Sie vorsichtig 10 Mikroliter Docos-Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung oder DPBS am äußersten Ende der Spitze tropfen lassen, und trocknen Sie die Spitze dann mit einem Kim-Tuch ab. Wiederholen Sie diesen Vorgang fünfmal nach dem Spülen mit DPBS bei einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter.
Avide in Lösung. Tropfenweise über die Spitze. Die Spitze nach der Avadon-Beschichtung fünf Minuten lang inkubieren lassen.
Spülen Sie die Spitze fünfmal zusätzlich mit DPBS. Anschließend wird biotinyliertes Fibronectin durch Zugabe einer Lösung mit einem Milligramm pro Milliliter tropfenweise auf die Spitze aufgetragen und fünf Minuten lang inkubiert, um es an das Avadon zu vernetzen.
Schließlich spülen Sie die Spitze erneut fünfmal mit DPBS, wobei der letzte Tropfen an der Spitze verbleibt. Sobald die Spitze vorbereitet ist, montieren Sie sie auf einem FM-Scanner. Nachdem die FM-Spitze montiert ist, setzen Sie einen schützenden Silikonrock um den Halter.
Danach das Mikroskop für die Videoaufnahme einrichten. Anschließend eine FM-Spitze in der Mitte des Sichtfelds ausrichten. Den optischen Hebel einstellen, indem der Laserstrahl am äußersten Ende des Cantilevers positioniert wird.
Ändern Sie dann das Objektiv zum geeigneten Hochleistungs-Objektiv für die Einzelzell-Aufnahme. Bringen Sie anschließend die Zelle, die mechanisch stimuliert werden soll, in den Bildausschnitt und wählen Sie eine Stelle aus, an der die AFM-Spitze auf der Zelloberfläche auftreffen soll. Senken Sie schließlich die AFM-Spitze ab, bis sie auf dieser spezifischen Zelle aufsetzt.
Nachdem die Spitze mit der Zelle in Kontakt gebracht wurde, warten Sie etwa 20 Minuten. Dies ermöglicht die Bildung einer stabilen fokalen Adhäsion an der FM-Kontaktstelle auf der Zelloberfläche. Nach dieser Wartezeit kann das Verfahren zur mechanischen Stimulation beginnen, um das Experiment zur mechanischen Stimulation vorzubereiten.
Wechseln Sie von der Videokamera zur E-M-C-C-D-Kamera, um die fluoreszierenden Zellen zur Bildgebung sichtbar zu machen. Erstellen Sie anschließend ein erstes Bild der ruhenden Zelle. Verwenden Sie die Spinning-Disk- und die konfokale Mikroskopie zur Visualisierung des Aktinzytoskeletts im gesamten Zellkörper.
Verwenden Sie umgekehrt Turf, um fokale Adhäsionen zur Stimulation der Zelle darzustellen. Nutzen Sie den Hebel, um alle drei bis fünf Minuten schrittweise eine kontrollierte Aufwärtsbewegung auszuüben. Während der Erfassung der A FM-Daten ist es wichtig, dass der Bediener stets die Spannung der Z-Piso-Position überwacht, um den richtigen Zeitpunkt für die vertikale Säule zu bestimmen.
Gleichzeitig mit der Erfassung der FM-Daten wird mithilfe der SlideBook-Software ein konfokales oder TURF-Bild der Zelle nach jedem vertikalen Zug aufgezeichnet. Schließlich wird die FM-Spitze aus der Zelle zurückgezogen, sobald das Stimulationsexperiment abgeschlossen ist. Eine vaskuläre glatte Muskelzelle, transfiziert mit Actin-MRFP und Vinculin (vcul).
GFP wurde mit einem FM an der apikalen Zelloberfläche abgebildet. Dasselbe Zell wurde mit Turf an der basalen Zelloberfläche abgebildet. Hier sind die beiden Bilder überlagert.
Ein Bild derselben Zelle wurde zusätzlich mithilfe der Spinning-Disk-Konfokalmikroskopie über den gesamten Zellkörper aufgenommen und als maximale Projektion eines 3D-Stapels dargestellt. Es zeigt sich eine gute Übereinstimmung zwischen den AFM- und den Spinning-Disk-Konfokalbildern. Diese vaskuläre glatte Muskelzelle, die mit Aktin-MRFP transfiziert wurde, wurde mechanisch durch die AFM stimuliert und mittels Spinning-Disk-Konfokalmikroskopie abgebildet.
Die Fehler weisen auf Aktinfilamente hin, die bemerkenswerte Umstrukturierungen nach einer FM-Stimulation zeigen. Einige Aktinfilamente polymerisieren, während andere aufgrund der mechanischen Stimulation depolymerisieren; weitere Aktinfilamente bündeln sich zusammen. Aufgrund der Aktin-Umstrukturierung haben wir Ihnen soeben gezeigt, wie man eine lebensfähige Zellkultur mechanisch mittels EFM stimuliert und gleichzeitig die Umorganisation des Cytoskeletts mittels optischer Bildgebungsmethoden aufzeichnet.
Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass ein FM-Experiment äußerst rauschanfällig und empfindlich ist. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Untersuchungen.
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Übersicht
Diese Studie stellt ein Protokoll zur Verwendung eines integrierten atomaren Kraft-Optik-Mikroskops zur mechanischen Stimulation lebender Zellen in Kultur vor. Die Methodik umfasst eine Schritt-für-Schritt-Anleitung und zeigt repräsentative Daten zu den Reaktionen lebender Zellen auf mechanische Stimulation.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellbiologie
- Mechanische Stimulation
- Live-Cell-Bildgebung
Hintergrund
- Das Verständnis der Zellreaktion auf mechanische Reize ist entscheidend für die Zellbiologie.
- Mittels Rasterkraftmikroskopie können Zellen präzise manipuliert werden.
- Mittels Live-Cell-Imaging lassen sich Echtzeiteinblicke in zelluläre Prozesse gewinnen.
- Fokale Adhäsionen spielen eine zentrale Rolle bei der Zelladhäsion und -reaktion.
Zweck der Studie
- Erläuterung der Bedienung eines spezialisierten Mikroskops für Untersuchungen an lebenden Zellen.
- Veranschaulichung der Auswirkungen mechanischer Stimulation auf lebende Zellen.
- Bereitstellung einer detaillierten Anleitung, die es Forschern ermöglicht, die Studie zu replizieren.
Verwendete Methoden
- Zellen, die GFP-Fusionsproteine exprimieren, werden in Glasgefäßen kultiviert.
- Die AFM-Spitze ist mit biotinyliertem Fibronectin beschichtet.
- Mit der funktionalisierten AFM-Spitze werden fokale Adhäsionen mit der Zelloberfläche erzeugt.
- Mechanische Stimulation wird durch kontrollierte Aufwärtsbewegung der AFM-Spitze angewendet.
Hauptergebnisse
- Die Zellen verstärkten ihre Anheftung an das Substrat nach Stimulation.
- Es wurde eine Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts als Reaktion auf mechanische Kräfte beobachtet.
- Mittels Echtzeit-Fluoreszenzbildgebung wurden dynamische zelluläre Reaktionen erfasst.
- Das Protokoll demonstrierte erfolgreich die Wirksamkeit der Technik.
Schlussfolgerungen
- Das integrierte Mikroskop ermöglicht die effektive Untersuchung lebender Zellreaktionen auf mechanische Reize.
- Diese Methode kann das Verständnis zellulärer Mechanik und Adhäsion verbessern.
- Zukünftige Anwendungen könnten die Untersuchung verschiedener Zelltypen und Bedingungen umfassen.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Das Verständnis dafür, wie lebende Zellen mechanische Kräfte wahrnehmen und sich anpassen, ist entscheidend, um Risiken bei der Zielvalidierung in Mechanotransduktionswegen zu minimieren. Dieser integrierte AFM-optische Bildgebungsansatz ermöglicht die zeitlich aufgelöste, subzelluläre Beobachtung von Zytoskelett- und Adhäsionsdynamiken und liefert so eine vorhersagbare Sicherheit in der frühen Entdeckungsphase, indem mechanische Reize mit struktureller Neuorganisation verknüpft werden. Die Methode unterstützt die mechanistische Risikominimierung, indem sie direkt die kraftinduzierte Neuausrichtung von Aktin und die Verstärkung fokaler Adhäsionen sichtbar macht und damit Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch in der präklinischen Zielstrukturauswahl unterstützt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Untersucht therapeutische Hypothesen, indem aufgezeigt wird, wie mechanische Stimulierung die Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts und die Verstärkung fokaler Adhäsionen auslöst.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die funktionelle Validierung von Zielstrukturen durch direkte Beobachtung kraftabhängiger zytoskelettaler Dynamik in lebenden adhärenten Zellen.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Selektion von Wirkstoffkandidaten, indem mechanische Eingaben mit strukturellen Ausgaben verknüpft werden und damit Unsicherheiten bei der Bindung mechanosensitiver Zielstrukturen verringert werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Workflows vor, indem reproduzierbare Protokolle für mechanische Stimulation und Echtzeit-Bildgebung etabliert werden.
- Operationaler Wert: Schafft Standardisierung von Assays und quantitative Ausgaben durch kontrollierte Bewegung der AFM-Spitze und synchronisierte Fluoreszenz-Messungen.
- Skalierbarkeit: Unterstreicht die Wiederverwendbarkeit der Plattform für verschiedene adhärente Zelltypen und ermöglicht zuverlässige Wirkstoffevaluierung in Screening-Kampagnen der Mechanobiologie.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Erläutert die Krankheitsrelevanz, indem die Kopf-zu-Basis-Strukturkopplung gezeigt wird, bei der eine apikale Stimulation eine Umorganisation im gesamten Zellkörper auslöst.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Beschreibt den kontinuierlichen Übergang von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem dynamische Reaktionen erfasst werden, die die Ausrichtung von Biomarkern in Mechanotransduktionswegen unterstützen.
- Mechanistische Entlastung: Konzentriert sich auf den prädiktiven Entlastungswert, indem dargestellt wird, wie die Kraftanwendung zu Aktinpolymerisation, -depolymerisation und -Bündelung führt und damit den Wirkmechanismus klärt.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Hypothesenprüfung bis hin zur Identifizierung von Leitverbindungen und unterstützt mechanistische Erkenntnisse vor der Verbindungsscreening-Phase.
- Entdeckungsbiologie: Erläutert, wie die Methode die Hypothesenprüfung unterstützt, indem gezielte mechanische Reize gesetzt und die zytoskelettale Umgestaltung in Echtzeit beobachtet wird.
- Screening: Beschreibt die Bereitschaft des Assays anhand reproduzierbarer Fokalkontakt-Bildung und quantitativer Abbildung der Aktin-Dynamik mittels TIRF- und konfokaler Verfahren.
- Analytik: Betont Messgrößen wie Aktin-Polymerisations- und Depolymerisationsereignisse sowie Intensitätsänderungen der fokalen Adhäsionen, die den Vergleich stimulierter und ruhender Zellen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Methode mit der präklinischen Kontinuität, indem gezeigt wird, wie apikale mechanische Stimulation strukturelle Veränderungen durch den Zellkörper fortpflanzt – ein Prozess, der für die Kraftübertragung auf Gewebeebene relevant ist.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt die Methode als wiederverwendbare Fähigkeit dar, mechanosensitive Zielstrukturen in vaskulären, epithelialen und mesenchymalen Zellmodellen zu untersuchen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit bei der Zielvalidierung, Verringerung mechanistischer Mehrdeutigkeiten in Mechanotransduktionswegen.
- Operationaler Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit mechanischer Stimulation und multimodaler Bildgebung.
- Strategischer Wert: Bessere Go/No-Go-Entscheidungen, Kapitalwirksamkeit und verringertes biologisches Risiko in fortgeschrittenen Phasen mechanobiologischer Programme.
- Portfolio-Implikationen: Risikoadjustierte Priorisierungs- und Weiterentwicklungsentscheidungen basierend auf direkter Beobachtung kraftinduzierter zellulärer Anpassung.
Durchführungsaspekte
- Notwendige wissenschaftliche Expertise in der AFM-Operation, Live-Cell-Abbildung und zytoskelettalen Dynamik.
- Zu den Anforderungen an die Instrumentierung gehören ein integriertes AFM-TIRF-Konfokalsystem mit Schwingungsdämpfung und zwei EM-CCD-Kameras.
- Die Standardisierung über Teamgrenzen hinweg erfordert die Einhaltung des Protokolls hinsichtlich der Tip-Funktionalisierung, der Fokalkontaktbildung und des Zeitpunkts der Stimulation.
- Anpassungsüberlegungen beinhalten die Variation der Substratsteifigkeit, der Beschichtungsproteine und der Zelltypen, wobei die spezifische apikale Stimulation beibehalten werden muss.
- Zu den praktischen Einschränkungen zählen die Empfindlichkeit gegenüber Rauschen während der AFM-Messungen sowie die Notwendigkeit kontrollierter Umgebungsbedingungen, um Drift zu minimieren.
