Pseudofracture: eine akute periphere Gewebe Trauma-Modell

Wenn ein langer Knochen, wie beispielsweise ein Femur oder eine Tibia, bricht, werden das verletzte Muskelgewebe und die Weichteile freigelegten Knochenfragmenten und Knochenmark ausgesetzt. Daraufhin folgt eine starke Immunreaktion, die der Gewebereparatur dient. Ein Modell zur Untersuchung der Auswirkungen dieser Exposition kann durch die Gewinnung beider Femora und Tibiae erzeugt werden.

Von einer Spendertau. Die Knochen werden zerkleinert, um eine Knochenlösung herzustellen, die anschließend in den verletzten Oberschenkel einer Empfängertau injiziert wird. Anschließend werden die Immunreaktionen überwacht und Fernorganverletzungen beurteilt, um die Langzeiteffekte eines traumatisch bedingten Knochenbruchs zu untersuchen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden der peripheren Gewebetraumatisierung, wie dem Modell des beidseitigen Femurfrakturen, besteht darin, dass dieses Modell, das Pseudofrakturmodell, eine Langzeitüberlebensfähigkeit ohne Komplikationen durch verlängerte Anästhesie oder aufwändige Frakturfixationstechniken ermöglicht und somit die Untersuchung der Immunantworten im Spätstadium nach dem Trauma erlaubt. Bevor Sie mit dem Verfahren beginnen, bereiten Sie die folgenden Materialien vor: einen Eiskübel, chirurgische Instrumente mit Betadine, GREs Hämostaten, eine Mörser- und Stößelzange, 20-Gauge-Nadeln, eine Ein-Kubikzentimeter-Spritze, PBS-Anästhesie und eine Isofluran-Nasenkappe. Ein einzelnes euthanasiertes, alters- und gewichtsgerechtes Tier.

Die genetische Spendertauze sollte ausreichend Material für drei Empfänger bereitstellen. Befestigen Sie den Spender an einer Plexiglasscheibe, wobei Sie darauf achten sollten, die unteren Extremitäten nur an der Fußspitze zu fixieren. Rasieren Sie die unteren Extremitäten sorgfältig.

Anschließend vollständig mit Betadine und Alkohol abdecken, um Sterilität zu gewährleisten, um die langen Knochen der unteren Extremität zu entfernen; einen chirurgischen Schnitt in die Haut im inguinalen Bereich durchführen und den Hautschnitt entlang der gesamten Länge der Extremität bis zum Knöchel fortsetzen; die Haut zurückklappen und von der subkutanen Faszie und der Muskulatur sowohl medial als auch lateral abpräparieren. Danach eine Scherenklinge unter die Muskeln schieben, die anterior und lateral zur Tibia liegen. Die Klinge proximal und distal verschieben, um die Muskeln sauber vom darunterliegenden Knochen abzuheben.

Wenden Sie diese Technik an der hinteren und mittleren Unterseite der Tibia an, um die unterhalb der Tibia liegenden Muskeln zu lösen. Beim distalen Verschieben sollte auf der hinteren Seite nur minimaler zusätzlicher Kraftaufwand erfolgen, um die Fibula am proximalen Ende dieser Beinmuskeln von der Tibia abzubrechen. Durchtrennen Sie die Sehnen so nah wie möglich an ihren Ansätzen und ziehen Sie die Muskeln distal, während Sie gleichzeitig als Gruppe in abwärts gerichteter Weise an der Muskelgruppe ziehen. Ein kleiner Ruck löst die distalen Verbindungen aus dem Sprunggelenk, indem mit der Schere durch das Sprunggelenk geschnitten wird.

Lösen Sie die Tibia an dieser Stelle nicht vom Femur, da diese Verbindung zusätzlichen Hebel bietet, der bei der Präparation des Femurs aus dem Hüftgelenk hilfreich ist. Wenden Sie eine ähnliche Technik zur Freilegung der Muskeln vom Femur an. Führen Sie dies gegebenenfalls posterior sowie medial und lateral durch.

Schneiden Sie die distale Ansatzstelle dieser Muskelgruppen durch, um sie vom Kniegelenk zu lösen. Verlängern Sie den Hautschnitt nach Bedarf, um eine ausreichende Exposition zu erzielen, und verfolgen Sie darunter die Muskulatur. Um das Ende des Femurs aus dem Hüftgelenk zu präparieren, entfernen Sie den Femur und den anhängenden Tibia von der Spendertau und legen Sie sie auf sterile Gaze.

Trennen Sie die beiden Knochen am Kniegelenk, indem Sie jeden Knochen mit einer separaten Hand greifen und die beiden Knochen vorsichtig in entgegengesetzte Richtungen entlang ihrer langen AEs verdrehen oder rotieren. Um die verbleibenden Sehnenansätze von den langen Knochen zu entfernen, wickeln Sie ein vier mal vier großes Stück Mullbinde um die Länge des Knochens. Greifen Sie fest zu und kratzen Sie mehrmals die gesamte Länge der Knochen ab, um das verbleibende Gewebe von der Oberfläche zu entfernen.

Legen Sie die gesammelten Knochen in ein steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Transportieren Sie die Spenderknochen in einen gründlich desinfizierten生物sicherheitswerkbank. Zur Herstellung der Knochenlösung.

Die Haube sollte mit einem sterilen Feldverband, einem sterilen Mörser und Pistill, einer sterilen Pinzette, einem sterilen acht Milliliter fassenden Gefäß, steriler PBSA und einer Ein-Milliliter-Pipette mit entsprechenden Pipettenspitzen vorbereitet werden. Eine 100-Mikroliter-Pipette mit entsprechenden Spitzen, Ein-Milliliter-Spritzen und 20-Gauge-Nadeln. Mit Hilfe der Pinzette werden die Knochen in den Mörser überführt und mit dem Pistill vorsichtig zerkleinert. Ein Milliliter PBS wird mit der Pipette in den Mörser gegeben, und die verbleibenden Fragmente werden weiter unter kreisförmigen Bewegungen zerkleinert, um eine vollständige Resuspendierung sicherzustellen.

Fügen Sie dann ein weiteres Milliliter PBS hinzu und setzen Sie das Zerkleinern fort, um die Knochenlösung herzustellen, die eine rosa Färbung aufweisen sollte. Gießen Sie die Lösung langsam aus dem Mörser in das acht Milliliter fassende Gefäß, wobei sichergestellt werden muss, dass größere Rückstände zurückbleiben. Überführen Sie die Knochenlösung in eine Ein-Milliliter-Spritze.

Mit einer 20-Gauge-Nadel sollte die Knochenlösung auf Eis gehalten werden. Geben Sie einen Mikroliter der Knochenlösung auf eine Mac-Conkey-Platte und verteilen Sie diese gleichmäßig auf der Oberfläche. Inkubieren Sie die Platte 24 bis 48 Stunden, um Sterilität sicherzustellen.

Beginnen Sie das chirurgische Verfahren zur Verletzung von Weichgewebe und Injektion von Knochenlösung, indem Sie die Narkosetiefe einer mit Pentobarbital anesthetisierten Maus mittels Zehenquetschung überprüfen. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf eine Plexiglasscheibe und fixieren Sie das Tier, indem Sie dünne Streifen Klebeband mit der klebrigen Seite nach außen locker um den distalen Teil jedes Extremitätenansatzes wickeln, unter Verwendung von Oscar Five-Tierern mit Klinge der Größe 40. Rasieren Sie die Bauch-, Leisten- und Oberschenkelregionen des Tieres.

Überführen Sie die Maus auf das sterile Operationsfeld. Wischen Sie den Operationsbereich mit Betadine ab. Anschließend desinfizieren Sie ihn mit Alkohol.

Bringen Sie eine Nasenkappe am Tier an, die ein Gazestück mit einem Milliliter 99 %igem Isofluran enthält. Sobald die Atmung des Tieres zu verlangsamen beginnt, entfernen Sie die Nasenkappe. Falls während eines Teils des Verfahrens zusätzliche Anästhesie erforderlich ist, kann weiteres Pentobarbital injiziert oder Isofluran verabreicht werden.

Als Nächstes falten Sie einen sterilen Wundverband und legen ihn über die Maus, sodass nur die unteren Extremitäten und der Kopf freiliegen. Diese Weichteilverletzung ist eine beidseitige Quetschverletzung der Hintergliedmaßen. Stellen Sie sicher, dass die Maus so positioniert ist, dass die Hintergliedmaßen leicht abduziert und lateral rotiert sind.

Dies erleichtert den Zugang zum korrekten Muskel. Gruppieren Sie die Kniebeuger, um die Quetschverletzung durchzuführen. Bringen Sie einen großen 18 cm langen Hämostat am mittleren Bereich der hinteren Oberschenkelmuskulatur entlang des Femurs an, wobei die konvexe Krümmung des Hämostats zum Femur weist. Verriegeln Sie den Hämostat für nur 30 Sekunden mit dem ersten Klick.

Führen Sie die Nadel zwei bis drei Millimeter durch die Haut, während die Spitze der Schräge gerade die Femur berührt. Injizieren Sie 0,15 Milliliter der Knochenlösung in die zerquetschte Oberschenkelmuskulatur auf jeder Seite. Ziehen Sie die Nadel zurück und legen Sie schnell einen sterilen, behandschuhten Finger über die Injektionsstelle, um einen Rückfluss der Knochenlösung aus der Wunde zu verhindern.

Halten Sie diesen Finger einige Sekunden lang an dieser Stelle. Stellen Sie die Maus zurück in den Käfig und gewähren Sie volle Bewegungsfreiheit, sobald die Anästhesie nachlässt. Eine angemessene Schmerztherapie muss verabreicht werden, sobald die Maus aufwacht.

Dieses allgemeine Schema zeigt die biphasische Immunantwort nach einem Trauma zum Zeitpunkt der Nullstunde. Es wird ein Trauma ausgelöst. Darauf folgt eine frühe hyperinflammatorische Reaktion, die nach sechs Stunden ihren Höhepunkt erreicht und durch die Beurteilung systemischer Entzündungen sowie dysfunktionaler Fernorgane gemessen wird.

Die zweite Komponente der posttraumatischen Immunantwort ist eine verzögerte Immunsuppression, die anhand einer Dysfunktion der Immunzellen gemessen wird und als Tal etwa 48 Stunden nach dem Trauma dargestellt ist. Dies ist ein repräsentatives Diagramm der entzündlichen Zytokinantwort im Plasma, die früh nach einem Trauma auftritt, und ein Beispiel für systemische Entzündung. Fernorganstörungen, gemessen anhand von Leberschädigungen, zeigen innerhalb eines ähnlichen Zeitraums erhöhte Werte.

Dieses repräsentative Diagramm ist ein Beispiel, um die späte Immunzellfunktionsstörung nach einem Trauma hervorzuheben. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, stets Sterilität und präzise Handhabung während des gesamten Experiments sicherzustellen. Dies ist kein Modell einer echten Fraktur oder einer Wundinfektion.