Experimentelle Metastasierung und CTL adoptiven Transfer Immuntherapie Maus-Modell

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Wirksamkeit einer adoptiven Übertragung von tumorspezifischen T-Zellen als Immuntherapie in vivo zu untersuchen. Zunächst werden Tumorzellen mittels Injektion in die seitliche Schwanzvene in Mäuse übertragen, um Lungenmetastasen zu etablieren. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die tumortragenden Mäuse mit tumorspezifischen zytotoxischen T-Lymphozyten (CTLs) zu behandeln.

Der letzte Schritt besteht darin, Indiantusche zu verwenden, um Tumorknoten sichtbar zu machen und zu quantifizieren. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die CIE verschiedener Behandlungen durch Messung der Tumorgröße und Zählung der Anzahl der Tumorknoten zeigen. Hallo, mein Name ist Mary Zimmerman und ich bin Mitglied des Labors von Dr. Kevin Lu am Medical College of Georgia.

Hallo, mein Name ist Shelene Hu. Ich bin Studentin im zweiten Jahr und arbeite außerdem im Labor von Dr. Lou. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber herkömmlichen Methoden wie Überlebenskurven besteht darin, dass dieses Verfahren sowohl qualitativ als auch quantitativ ist. Die Anwendungsmöglichkeiten der Technik könnten sich auf die Krebstherapie erstrecken, da sie der adoptiven T-Zell-Immuntherapie bei menschlichen Krebspatienten nachempfunden ist.

Beginnen wir also am Tag vor den Tumorzellinjektionen mit der Aussaat einer T-75-Flasche mit bis zu 1 × 10⁷ CMS-4-Met-Zellen in 10 Milliliter RPMI-Medium, das 10 % Serum enthält. Um schnell wachsende Tumorzellen zu erhalten, über Nacht bei 37 °C inkubieren am Tag der Injektion.

Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS, anschließend lösen Sie die Tumorzellen mit 0,05 % Trypsin-EDTA bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten ab. Stoppen Sie die Reaktion mit 10 Milliliter RPMI-Medium, das 10 % Serum enthält. Überführen Sie die Zellen in ein kegelförmiges Reagenzglas.

Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1300 U/min in einer Val-Legend-RT-Zentrifuge für drei Minuten. Entfernen Sie bei Raumtemperatur den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 10 Milliliter frischem 1× HBSS zur Wäsche. Anschließend erneut zentrifugieren und auf dieselbe Weise resuspendieren.

Zählen Sie die Tumorzellen auf einem Hämocytometer. Verdünnen Sie die Zellen in HBSS, sodass die für jede Injektion benötigten Zellen resuspendiert werden. Erwärmen Sie die sechs bis acht Wochen alten B SEA-Mäuse in einem Becher, der in warmes Wasser eingetaucht ist, in einem Gesamtvolumen von 100 Mikrolitern.

Um die Schwanzvene zu weiten, platzieren Sie die Maus in einer Schwanzvenen-Haltevorrichtung auf dem Pult. Injizieren Sie mit einer Mikrospritze 100 µL Tumorzellen in die seitliche Schwanzvene. Wenden Sie eine septische Technik an, um nach der Injektion eine Infektion zu vermeiden.

Üben Sie leichten Druck auf die Injektionsstelle aus, bis die Blutung gestoppt ist. Bringen Sie die Maus zurück in den Käfig und lassen Sie den Tumor bis zum gewünschten Stadium wachsen. Am Tag der Übertragung pipettieren Sie auf und ab, um die aufgereinigten zytotoxischen T-Lymphozyten oder CTLs, die vorbereitet wurden, erneut in Suspension zu bringen.

Wie im Text beschrieben, überführen Sie alle Zellen von einer Platte in ein 15-Milliliter-Konischglas, wobei das Volumen nicht mehr als zwei Drittel des Glases überschreiten darf. Führen Sie eine sterile Pasteurpipette in das Konischglas ein und schichten Sie das Lymphozytenseparationsmedium oder LSM unter die Zellen, bis das Gesamtvolumen 14 Milliliter nahekommt.

Achten Sie darauf, die Schichten nicht zu stören. Zentrifugieren Sie bei 2000 U/min für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Verwenden Sie nicht die Bremse, um den Rotor nach dem Zentrifugieren abzubremsen; überführen Sie die CTLs in ein neues kegelförmiges 15-Milliliter-Röhrchen.

HBSS auf ein Volumen von etwa 10 Milliliter auffüllen. Zum Waschen. Die Zellen bei 1300 U/min fünf Minuten lang zentrifugieren und bei Raumtemperatur in HBSS auf die erforderliche Zelldichte für Injektionen resuspendieren.

Halten Sie das Gesamtvolumen pro Injektion bei 100 Mikrolitern. Verwenden Sie dieselbe Schwanzveneninjektionstechnik, wie sie zuvor in diesem Video gezeigt wurde. Um die CTLs in tumortragende Mäuse zu injizieren, bringen Sie die Maus zurück in den Käfig und lassen Sie die CTLs mit dem Tumor interagieren.

Mäuse werden zur Analyse gewöhnlich 14 bis 21 Tage nach der CTL-Behandlung getötet. Um Lungenmetastasen sichtbar zu machen, legen Sie eine getötete Maus auf den Rücken auf eine Styroporplatte. Befestigen Sie die Beine mit Nadeln, um ungehinderten Zugang zur Luftröhre zu gewährleisten.

Besprühen Sie die Bauchseite mit 70 % Ethanol, beginnend in der Bauchmitte. Schneiden Sie mit einer Schere entlang der Mittellinie durch den Brustkorb und weiter in Richtung der Speicheldrüsen. Legen Sie die Luftröhre frei.

Verwenden Sie eine Pinzette, um das Gewebe um die Luftröhre herum zu entfernen. Führen Sie eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze unter die Luftröhre, wobei Sie die Spitze mit einer Hand halten. Heben Sie die Luftröhre vorsichtig an und entfernen Sie sie vom Körper.

Drehen Sie die Plattform um 180 Grad. Injizieren Sie mit einer 50-Milliliter-Spritze Tinte über die Trachea in die Lungen. Füllen Sie die Lungen vollständig mit Tinte, bis Sie einen starken Widerstand spüren.

Verwenden Sie eine Schere, um die Luftröhre zu durchtrennen. Führen Sie eine Pinzette unter die Lungen ein und heben Sie sie aus der Maus heraus. Spülen Sie die Lungen kurz in einem Ein-Liter-Becher mit Wasser in einer chemischen Abzugshaube ab.

Überführen Sie die Lungen in eine Glasapparatur, die fünf Milliliter FTI-Lösung enthält. Das Tumorgewebe wird als weiße Knoten auf den schwarzen Lungen sichtbar. Nach einigen Minuten können die Tumore nun gezählt werden und bleiben unbegrenzt lang in der FTI-Lösung stabil.

Lungen von Mäusen, die mit Brustkarzinom transfiziert wurden. Die Zelllinie vier T eins zeigt weiße Flecken, die Tumore anzeigen. Mäuse, die mit einem dominant-negativen IRF-acht-Immunkonstrukt gegen K-79-E transfiziert wurden, zeigen das erhöhte metastatische Potenzial der Tumorzellen.

Diese Bilder zeigen eine histologische Analyse der Wirksamkeit einer adoptiven CTL-Immuntherapie. Mäuse mit Tumoren, die mit Kochsalzlösung injiziert wurden, wiesen sechs Tage später mehrere Tumore auf, die durch Pfeile gekennzeichnet sind. Dagegen zeigten Mäuse, die mit tumorspezifischen T-Zellen injiziert wurden, in demselben Experiment eine Verringerung der Tumore.

Die Behandlung mit Tusche bietet eine einfachere Möglichkeit, die Wirksamkeit der CTL-Autotransfusion zu messen. Hier unterscheiden sich die weißen Tumorknoten an tumortragenden Lungen deutlich von Lungen, die erfolgreich einer CTL-Autotransfusion unterzogen wurden, und das Zählen der Knoten ermöglicht eine Quantifizierung, die mit der Histologie nicht möglich ist. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Mäuse aufzuwärmen, um einfachere und genauere Injektionen in die Schwanzvene zu ermöglichen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Wirksamkeit der Behandlung mithilfe dieses einfachen Verfahrens zur Quantifizierung von Tumorgröße und -anzahl beurteilt werden kann. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.