Differential Imaging biologischer Strukturen mit doppelt-resonanten kohärente Anti-Stokes Raman-Streuung (CARS)

Dieses Video demonstriert ein Verfahren zur differentiellen Abbildung zweier Ramen-Resonanzen, die mit biologischen Strukturen assoziiert sind, mittels kohärenter Ramen-Streuungssignale. Zunächst werden drei synchronisierte Kurzpulslaser zeitlich und räumlich überlappt. Die überlappten Pulse werden anschließend an ein Standard-Invertiertmikroskop geleitet, das die Erzeugung kohärenter Ramen-Signale aus mikroskopischen Objekten ermöglicht.

Signale werden mithilfe kommerzieller Software in Bilder umgewandelt, um verschiedene erzeugte Ramen-Signale zu vergleichen. Die Ergebnisse zeigen, dass der Unterschied zwischen Bildern, die aus doppelt und einfach resonanten Ramen-Signalen gewonnen wurden, eine verbesserte Empfindlichkeit für schwache Ramen-Signale ermöglicht. Hallo, ich bin Tyler Weeks vom Zentrum für Bio-Photonik an der University of California Davis.

Ich bin Thomas ER vom Zentrum für Bio-Photonik und der Abteilung für Innere Medizin an der University of California Davis. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Nutzung der doppelt resonanten kohärenten anti-Stokes-Raman-Streuung, um chemisch spezifische Bilder von Zellen zu erzeugen. Wir verwenden dieses Verfahren, um Signale von Molekülen nachzuweisen, die zu schwach sind, um allein durch die kohärente anti-Stokes-Raman-Spektroskopie direkt detektiert zu werden.

Beginnen wir damit, Autos und Dr.-Autos-Signale gleichzeitig zu erzeugen. Dazu werden drei abstimmbare und synchronisierte Kurzpulslaserquellen benötigt, um diese synchronisierten Pulse zu erhalten. Beginnen Sie mit einem einzelnen Kurzpulslaser mit einer Ausgangsleistung von 10 Watt, einer festen Wellenlänge von 1064 Nanometern, einer festen Pulslänge von sieben Pikosekunden und einer festen Wiederholrate von 76 Megahertz.

Mithilfe einer Reihe von Halbwellenplatten und polarisierenden Strahlteilerwürfeln wird der Strahl in drei Teile aufgeteilt. Eine Halbwellenplatte in Kombination mit einem polarisierenden Strahlteilerwürfel ermöglicht die Einstellung der Leistung in jeder Strahlkomponente, ohne deren Richtung zu verändern. Üblicherweise werden zwei Strahlen jeweils auf etwa 4,5 Watt eingestellt, während der dritte Strahl das verbleibende eine Watt enthält.

Die beiden Hochleistungsstrahlen werden anschließend in zwei unabhängige optische parametrische Oszillatoren oder OPOs gelenkt. OPOs nutzen die Erzeugung unterschiedlicher Frequenzen, um ein Photon mit hoher Energie in zwei Photonen mit niedrigerer Energie und unterschiedlichen Wellenlängen umzuwandeln. Durch die Steuerung der Temperatur des zur Erzielung dieses Effekts verwendeten Kristalls können die Wellenlängen der resultierenden Photonen auf 0,1 Nanometer genau geregelt werden.

Durch Frequenzverdopplung dieser Signale kann ein Laser mit einer festen Wellenlänge von 1064 Nanometern nun in einen Laserstrahl umgewandelt werden, der zwischen 780 Nanometern und 910 Nanometern abgestimmt werden kann, indem zwei separate OPOs mit derselben 1064-Nanometer-Quelle gepumpt werden. Es werden zwei unabhängig abstimmbare Laserquellen erhalten, die automatisch mit unserem ursprünglichen Pump-Laser synchronisiert sind. Der dritte Strahl des 1064-Nanometer-Pump-Lasers wird durch eine Kombination aus dielektrischen Spiegeln um die OPOs herumgelenkt, sodass alle drei Strahlen später wieder kombiniert werden können.

Um kohärente Ramansignalphotonen effizient zu erzeugen, müssen die rekombinierten Pulse sowohl zeitlich als auch räumlich überlappen, da die OPOs Ringresonatoren enthalten, die es jedem Laserpuls ermöglichen, mehrfach durch den Kristall zu laufen. Der durch die OPOs gesendete Strahl legt dadurch eine zusätzliche Strecke zurück, was im Vergleich zum ursprünglichen Pumpstrahl zu einer erheblichen Verzögerung führt. Dieser Wegunterschied muss durch einen dritten Strahl ausgeglichen werden, indem zusätzliche Spiegel eingefügt werden, die diesen Strahl zwingen, dieselbe Distanz wie die beiden anderen zurückzulegen, bevor sie mithilfe von dichroitischen Spiegeln rekombiniert werden, um eine feine Justierung der Pfadlänge zu ermöglichen. Jeder Strahl wird durch justierbare Verzögerungsstufen geleitet, die eine Anpassung des zeitlichen Überlapps der verschiedenen Laserpulse erlauben.

Ein weiterer Satz von Halbwellenplatten und polarisierenden Strahlteilerwürfeln wird jedem Strahl hinzugefügt, um die Laserleistung jedes Strahls unabhängig voneinander einstellen zu können. Dichroitische Spiegel werden verwendet, um zunächst die Strahlen der beiden OPOs zu kombinieren, und anschließend muss beim 1064-Nanometer-Strahl darauf geachtet werden, dass die Strahlen räumlich exakt überlappen. Dies kann überprüft werden, indem die Überlappung der Strahlen innerhalb weniger Zentimeter vor dem dichroitischen Spiegel mit derjenigen in etwa einen Meter hinter dem dichroitischen Spiegel verglichen wird.

Da die Exposition gegenüber Laserstrahlen mit hoher Durchschnittsleistung die Probe beschädigen kann, werden die drei kombinierten Strahlen durch einen elektrooptischen Modulator geleitet, der als Pulsauswahlgerät fungiert und die Einstellung der Wiederholrate der die Probe erreichenden Pulse – und damit der Durchschnittsleistung – ermöglicht. Die kombinierten Laserstrahlen werden anschließend in ein aufrechtes Mikroskop mit einer Objektivlinse mit hoher numerischer Apertur oder NA eingekoppelt. Die enge Fokussierung, die durch das Objektiv mit hoher NA erzeugt wird, ermöglicht die effizienteste Erzeugung kohärenter Raman-Signale auf mikroskopischen Längenskalen.

Das Objektiv des Mikroskops ist auf einer X-, Y-, Z-Piezo-Plattform montiert, die es ermöglicht, Bilder durch Rasterabtastung der Strahlen über die Probe zu gewinnen, ähnlich wie bei kommerziellen Strahlabtast- und konfokalen Mikroskopen. Nun sehen wir uns an, wie CARS- und D-R-F-W-M-Signale erzeugt werden: Die Wechselwirkung dreier kurzer Laserpulse an der Probe führt zur Erzeugung mehrerer Vier-Wellen-Mischungssignale, wie beispielsweise CARS aus verschiedenen Kombinationen zweier Laser sowie Dreifarb-CARS- und DR-CARS-Signale aus der Kombination aller drei Laser. Wenn die Signale in der Wellenlänge nahe beieinander liegen, kann es schwierig sein, sie zur Analyse voneinander zu trennen.

Aus diesem Grund werden Signale in ein abbildendes Spektrometer geleitet, das ebenfalls als Monochromator oder Bandpassfilter fungiert, um Signale unterschiedlicher Wellenlängen räumlich zu trennen. Ein elektronisch betätigter Kippspiegel innerhalb des Spektrometers leitet im abgesenkten Zustand das Signal zu einer rückseitig belichteten, tiefdepletierten CCD-Kamera (charge coupled device), die spektroskopische Informationen über den gesamten Signalbereich liefert und es uns ermöglicht, die verschiedenen kohärenten Robin-Signale zu identifizieren und zu optimieren, um das zu bildende Signal auszuwählen. Drehen Sie einfach das Beugungsgitter innerhalb des Spektrometers mithilfe der vom Hersteller bereitgestellten Steuer- und Datenerfassungssoftware, um den gewünschten Peak auf der CCD-Kamera zu zentrieren.

Danach die Position des Umlenkspiegels verändern, um das Signal auf einen zweiten Ausgangsport umzuleiten, an dem ein einzelner Photonenzähl-Avalanche-Fotodetektor (DDE) oder ein Fotodetektor (PD) angeschlossen ist. Rastern. Das Objektiv abtasten und anschließend die auf dem APD aufgezeichneten Signale verwenden, um mithilfe der Datenerfassungssoftware ein Bild zu erzeugen, indem die Photonenzählrate für jedes Pixel dargestellt wird. Dieses Abbildungsverfahren für jedes gewünschte kohärente Raman-Signal wiederholen, sodass die Signale während der Nachbearbeitung verglichen werden können.

Jetzt sehen wir uns an, wie man eine Probe korrekt präpariert, um klare und reproduzierbare Bilder zu erhalten. Bei der Probenvorbereitung ist Vorsicht geboten. Proben werden typischerweise auf etwa 150 Mikrometer dicken Glasdeckgläsern präpariert.

Diese Deckgläser sind dünn genug, um eine hochauflösende Bildgebung mit den hochnumerischen (NA) Wasser- oder Öl-Immersionobjektiven zu ermöglichen, die in diesen Experimenten verwendet werden. Um die Vorbereitung einer typischen Probe zu demonstrieren, bereiten wir etwa 20 Mikrometer dicke Schnitte von fixiertem Maus-Muskulaturgewebe auf einem Objektträger vor. Ein 20-Mikroliter-Tropfen einer fünf Mol schweren Glucoselösung wird der Probe hinzugefügt.

Die deuterierte Glucoselösung liefert eine eindeutige und starke Raman-Hintergrundsignatur. Ein Glasdeckel wird auf die Probe gelegt und mit Nagellack fixiert, um Zellen und Kultur zu stabilisieren. Es können auch Kulturschalen mit Glasboden verwendet werden, die eine Bildgebung ermöglichen, ohne dass die Zellen von ihren Zellkulturschalen abgelöst werden müssen.

Jetzt wollen wir uns ansehen, wie man die geeigneten Raman-Linien und -Peaks für Dr. Cars bestimmt. Um den Effekt der doppelt resonanten Verstärkung richtig auszunutzen, müssen die Raman-Spektren beider resonant verstärkter Substanzen bekannt sein. Typischerweise handelt es sich dabei um 2.845 cm⁻¹, die mit Lipiden assoziiert sind, und um 2.121 cm⁻¹ für die CD-Streckmode, die mit deuterierter Glukose verknüpft ist.

Kohärente Ramanstreuung wird erreicht, wenn die Frequenzdifferenz zwischen zwei Lasern der Frequenz einer molekularen Schwingung entspricht. Indem ein OPO auf 817 Nanometer abgestimmt wird, untersucht es die 2.845 cm⁻¹ C-Schwingung in Kombination mit dem 1064-Nanometer-Laserstrahl; wird das andere OPO auf 868 Nanometer abgestimmt, so untersucht es die 2.121 cm⁻¹-Schwingung in Kombination mit dem 1064-Nanometer-Strahl. Im spektroskopischen Modus ermöglicht das CAR-Mikroskop die Beobachtung von drei kohärenten Ramansignalen von Interesse: ein CAR-Signal, das die CH-Streckenschwingung untersucht, ein CAR-Signal, das den CD-Streckmodus untersucht, und ein DR-CAR-Signal, das beide untersucht. In dem hier gezeigten Diagramm zeigen gestrichelte Pfeile Photonen von den Lasern in den OPOs und durchgezogene Pfeile das resultierende Signal.

Die durchgezogenen horizontalen Linien zeigen die Energie der Ramen-Schwingung an und veranschaulichen, dass bei DR-Autos gleichzeitiges Mischen derselben drei Eingangsphotonen zwei verschiedene Ramen-Schwingungen untersucht. Die Signalamplitude jedes Peaks muss durch Feinabstimmung in der Umgebung dieser Peak-Positionen optimiert werden. Hier wählen wir jeden Peak aus und nehmen Bilder von See-Elgan-Würmern in einer Lösung aus abgeschwächtem Glukose auf; die Gewinnung zusätzlicher Informationen basierend auf diesen drei separat aufgenommenen Bildern erfordert eine relativ einfache Bildverarbeitung.

Zunächst müssen die Bilder normalisiert werden. Eine praktische Methode zur Normalisierung beruht auf der Tatsache, dass Lipide hydrophob sind. Dies bedeutet, dass in Bereichen mit hoher Lipiddichte der CD-Resonanzbeitrag der Glukose zum doppelt resonanten Signal nur gering sein sollte.

Umgekehrt sollten in Bereichen mit reiner Glucoselösung die CH-Resonanzen der Lipide ebenfalls nur geringfügig beitragen. Vor diesem Hintergrund normieren Sie das DR-car-Bild und das auf der CD-Resonanz der deuterierten Glucoselösung erhaltene car-Bild auf einen Bereich deutlich außerhalb des CL-egan-Wurms, der keine CH-Resonanz aufweisen sollte. Identifizieren Sie anschließend einen Bereich innerhalb des Wurms im CH-resonanten car-Bild, der reich an Lipiden ist, und normieren Sie diesen auf den entsprechenden Bereich innerhalb des normalisierten DR-car-Bildes.

Um sicherzustellen, dass diese Methode korrekt funktioniert, wird vorausgesetzt, dass in tieferen Bereichen dieser Region kein deuteriertes Glukose vorhanden ist. Diese Annahme ist gerechtfertigt, da die Lipide hydrophob sind und sich nicht mit der Lösung mischen werden. Indem nun das normalisierte CH-Resonanz-CAR-Bild vom normalisierten DR-CAR-Bild subtrahiert wird, verbleibt lediglich das verstärkte CD-Resonanzsignal, analog dazu durch Subtraktion des normalisierten CD-Resonanz-CAR-Bildes vom normalisierten Dr.FWM-Bild.

Nur das verstärkte CH-Resonanzsignal bleibt übrig. Hier ist das Raman-Spektrum für eine modifizierte Ölsäure, die eine Alkin-Modifikation enthält: Die starken CH-Resonanzen bei 2.845 cm⁻¹ und die Alkin-Resonanz bei 2.121 cm⁻¹ sind beide gut vom Fingerabdruckbereich isoliert, also dem Bereich mit dicht gepackten Peaks, wodurch sie ideale Marker für die kohärente Raman-Bildgebung darstellen. Dies ist ein typisches Spektrum kohärenter Raman-Signale, die entstehen, wenn drei Kurzpulslaser im Probeninneren überlappen. Die Pfeile zeigen auf die Prozesse, die für jedes Signal verantwortlich sind, wie sie durch Energiediagramme dargestellt werden.

Dies sind typische Ergebnisse der Bildgebung von C. Elgin's Würmern mittels DR-Autos und Autos. Die obere Zeile verwendete die zuvor gezeigten drei Signale, um einen Wurm in einer Lösung mit reduziertem Glukosegehalt abzubilden. In der zweiten Zeile wurden die Bilder entsprechend normalisiert, und in der dritten Zeile wurden Differenzbilder erzeugt, indem jeweils die Bilder des Autos von den Bildern des DR-Autos subtrahiert wurden. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man eine Raman-Differenzbildgebung basierend auf der doppelt resonanten kohärenten anti-Stokes-Raman-Mikroskopie durchführt.

Beachten Sie bei diesem Verfahren, dass es wichtig ist, sicherzustellen, dass die Strahlen richtig überlappen und synchronisiert sind. Außerdem sollten Sie beim Wechsel zwischen verschiedenen kohärenten Signalen darauf achten, die Probe nicht zu stoßen oder zu bewegen, da dies die Analyse beeinflussen würde. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.