Multimodale optische Bildgebungsplattform zur Untersuchung des zellulären Stoffwechsels
6. Juni 2025
Unter Verwendung einer multimodalen Plattform, die markierungsfreie optische Bildgebungsmodalitäten kombiniert, haben wir ein Protokoll zur Visualisierung und Quantifizierung der zellulären Dynamik und des Stoffwechsels entwickelt. Durch Bildgebung mittels Multiphotonenfluoreszenz, Erzeugung der zweiten Harmonischen und stimulierte Raman-Streumikroskopie können wir einen ganzheitlichen Überblick über die zelluläre und molekulare Umgebung erhalten.
Unsere Forschung umfasst die Nutzung unseres multimodalen Mikroskops, um molekulare und metabolische Unterschiede in verschiedenen Pathologien zu messen und ihre räumliche Heterogenität sichtbar zu machen. Der multimodale Ansatz der optischen Bildgebung ermöglicht es uns, pathophysiologische Veränderungen aus einer Vielzahl von Perspektiven zu identifizieren. Der multimodale Ansatz der optischen Mikroskopie erweitert kontinuierlich seine Anwendungen, insbesondere im klinischen Umfeld, wo die Entwicklung von Mikroendoskopen einen Weg für die klinische Bildgebung eröffnet hat.
Die aktuellen experimentellen Herausforderungen liegen in der Komplexität, die gesamte Hardware miteinander zu verbinden, was einer der Gründe ist, warum wir ein maßgeschneidertes Mikroskopsystem verwenden. Durch den Einsatz unserer multimodalen optischen Bildgebungsplattform haben wir bedeutende Fortschritte bei der markierungsfreien bioorthogonalen Krankheitsforschung gemacht, einschließlich der Klassifizierung verschiedener Brustkrebs-Subtypen und der Analyse des Fettstoffwechsels in der Drosophila und im Gehirn von Mäusen. Mit unserer markierungsfreien multimodalen optischen Bildgebung sind wir in der Lage, den Stoffwechsel, die Morphologie und die molekulare Zusammensetzung gleichzeitig zu visualisieren, was ein leistungsstarkes Werkzeug für die Untersuchung von Krankheiten und des Alterungsprozesses ist.
Um zu beginnen, wärmen Sie den Laser auf und warten Sie etwa 15 bis 20 Minuten. Schalten Sie die Steuerbox ein, gefolgt von dem Touchpanel-Controller, dem Netzteil für die Haupt-Laserfernbedienung und dem Netzteil für die Sub-Laser-Fernbedienung, dann schalten Sie dann den Silizium-Fotodiodendetektor und den Lock-in-Verstärker ein. Richten Sie das Lasersystem mit einem Pumpstrahl ein, der von 780 Nanometern bis 990 Nanometern abstimmbar ist, mit einer Pulsbreite von fünf bis sechs Pikosekunden und einer Wiederholrate von 80 Megahertz.
Der Stokes-Laserstrahl soll eine feste Wellenlänge von 1031 Nanometern haben, mit einem Puls von sechs Pikosekunden und einer Wiederholrate von 80 Megahertz. Stellen Sie sicher, dass sowohl der Pumpen- als auch der Fokes-Strahl eine geringe Leistung von mindestens 20 Milliwatt haben, damit sie auf der Ausrichtungsplatte sichtbar sind. Tragen Sie Öl auf den Ölkondensator mit hoher numerischer Apertur auf.
Montieren Sie den Objektträger auf den Ölkondensator und platzieren Sie einen großen Wassertropfen auf dem Objektträger für das 25X-Wasserobjektiv. Stellen Sie den Z-Tisch so ein, dass der Fokus so eingestellt wird, dass das helle Hellfeldbild der biologischen Probe unter dem 25-fachen Wasserobjektiv sichtbar ist. Beginnen Sie den Bildgebungsprozess in der richtigen Reihenfolge, um Photobleaching zu vermeiden.
Um schnell zwischen MPF und SHG zu wechseln, wechseln Sie vom Pumpbalken auf den festen Stokes-Strahl. Wählen Sie die Bildauflösung als 512 x 512 Pixel. Legen Sie die Verweilzeit auf acht Mikrosekunden pro Pixel für MPF und SHG fest, mit einem durchschnittlichen Frame über drei.
Verwenden Sie 40 Mikrosekunden pro Pixel mit einem durchschnittlichen Frame von zwei für die SRS-Modalität. Um Autofluoreszenz mit MPF zu erhalten, schalten Sie den Stokes-Laserstrahl aus. Stimmen Sie den Pumplaser auf 800 Nanometer ab, um NADH und Flavin anzuregen.
Erfassen Sie das Kollagenfasersignal mit SHG. Schalten Sie den Pumplaserstrahl aus und verwenden Sie den Stokes Laserstrahl nur mit einer Leistung von 500 Milliwatt. Erhalten Sie die räumliche Verteilung von Proteinen und Lipiden mit SRS.
Lassen Sie beide Laserstrahlen eingeschaltet und passen Sie die Frequenz des Laserstrahls an den spezifischen Schwingungsmodus für jedes Molekül an. Um die hyperspektralen SRS-Bilddatensätze zu erfassen, wählen Sie den Suite-Modus und stellen Sie den Wellenlängenbereich von 781,3 Nanometern bis 806,5 Nanometern ein. Wählen Sie eine Stapelnummer von mindestens 60 und erfassen Sie den hyperspektralen Bildstapel.
Speichern Sie alle Bilder derselben Interessenbereiche im selben Ordner und stellen Sie sicher, dass das Bildformat eine Olympus OIR-Datei ist. Mit der Autofluoreszenz- und SRS-Bildgebung wurden metabolische und strukturelle Informationen aus menschlichem Lungengewebe erfolgreich erfasst. Die ratiometrische Analyse des optischen Redoxverhältnisses und des Lipidunsättigungsverhältnisses lieferte räumliche Verteilungen der Stoffwechselaktivität und der molekularen Zusammensetzung im menschlichen Lungengewebe.
Der quantitative Vergleich von oxidativem Stress und Lipidunsättigung zwischen gesundem Gewebe und Tumorgewebe zeigt Unterschiede in den Stoffwechselzuständen.
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Übersicht
Diese Studie stellt eine multimodale optische Bildgebungsplattform vor, die die Visualisierung und Quantifizierung zellulärer Dynamik und des Stoffwechsels ermöglicht. Durch den Einsatz verschiedener Bildgebungstechniken können Einblicke in die zelluläre und molekulare Umgebung bei unterschiedlichen Pathologien gewonnen werden.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Optische Bildgebung
Hintergrund
- Multimodale Mikroskopie ermöglicht die Messung molekularer und metabolischer Unterschiede.
- Sie bietet einen ganzheitlichen Überblick über pathophysiologische Veränderungen.
- Die Anwendungen erweitern sich in klinischen Umgebungen, insbesondere mit Mikroendoskopen.
- Speziell konstruierte Mikroskopsysteme begegnen experimentellen Herausforderungen.
Zweck der Studie
- Um Stoffwechsel, Morphologie und molekulare Zusammensetzung gleichzeitig darzustellen.
- Um Krankheiten und den Alterungsprozess zu untersuchen.
- Um verschiedene Subtypen von Brustkrebs zu klassifizieren.
Verwendete Methoden
- Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopie
- Mikroskopie der zweiten harmonischen Erzeugung
- Stimulierte Raman-Streumikroskopie
- Markierungsfreie bioorthogonale Bildgebungsverfahren
Hauptergebnisse
- Bedeutende Fortschritte beim Verständnis des Lipidstoffwechsels in Modellorganismen.
- Identifizierung räumlicher Heterogenität in zellulären Dynamiken.
- Klassifizierung von Brustkrebs-Subtypen mithilfe bildgebender Verfahren.
- Verbesserte Visualisierung metabolischer Prozesse im Gehirn.
Schlussfolgerungen
- Der multimodale Ansatz ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung von Krankheiten.
- Markierungsfreie Abbildungstechniken liefern umfassende Einblicke in zelluläre Umgebungen.
- Zukünftige Anwendungen könnten die klinischen Bildgebungsmöglichkeiten weiter verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Mehrgleisige optische Bildgebungssysteme, die MPF-, SHG- und SRS-Modalitäten integrieren, ermöglichen eine simultane, markierungsfreie Quantifizierung des zellulären Stoffwechsels, der Morphologie und der molekularen Zusammensetzung mit subzellulärer Auflösung. Diese Fähigkeit trägt einem zentralen Bedarf an informationsreichen, räumlich aufgelösten metabolischen und strukturellen Daten in der frühen Forschung und der translationsorientierten Forschung Rechnung und unterstützt die Vorhersagegenauigkeit bei der Krankheitsmodellierung und der mechanistischen Risikominimierung. Die Fähigkeit des Systems, mehrere funktionelle Messgrößen aus derselben biologischen Region zu korrelieren, verbessert die Entscheidungsfindung im Portfolio und die risikoadjustierte Weiterentwicklung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte Visualisierung und Quantifizierung metabolischer Aktivität und molekularer Heterogenität in krankheitsrelevanten Systemen.
- Unterstützt die mechanistische Risikominimierung durch Korrelation metabolischer Zustände mit strukturellen und zusammensetzungsbasierten Merkmalen.
- Erleichtert die funktionelle Target-Validierung durch markierungsfreie, multiplexe Bildgebung lebender Zellen und Gewebe.
Screening und Assay-Entwicklung
- Liefert validierte und reproduzierbare Bildgebungsdaten zur quantitativen Beurteilung metabolischer und struktureller Biomarker.
- Unterstützt die Standardisierung von Assays, indem gleichzeitige Aufnahmen mehrerer Modalitäten aus demselben Probenbereich ermöglicht werden.
- Beschleunigt die Eignung für die Hochdurchsatz-Screening-Analyse, indem der Bedarf an exogenen Markern verringert und die Probendestruktion minimiert wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Korreliert metabolische und molekulare Bildgebungsdaten mit dem Krankheitsverlauf und der therapeutischen Ansprechrate in präklinischen Modellen.
- Ermöglicht die räumliche Abbildung metabolischer Heterogenität, die für die Tumorbiologie und Neurodegeneration relevant ist.
- Unterstützt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem ortsfeste, markierungsfreie Messgrößen bereitgestellt werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese multimodale Bildgebungsplattform verbindet die frühe Entdeckung, die Identifizierung von Wirkstoffkandidaten und die präklinische Forschung, indem sie multiplexierte, quantitative Daten aus intakten biologischen Systemen liefert.
- Entdeckungsbiologie: Integriert Hypothesentests und die Aufklärung von Wegen durch die Korrelation metabolischer, struktureller und zusammensetzungsbezogener Daten.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Bildgebungsdaten, die für vergleichende Analysen unter verschiedenen Bedingungen geeignet sind.
- Analytik: Bietet verhältnisbasierte und räumlich aufgelöste Messungen von oxidativem Stress und Lipid-Undesättigung für robuste statistische Analysen.
- Translationale Forschung: Ermöglicht die Zuordnung von bildgebenden Biomarkern zu Krankheitszuständen und therapeutischen Ergebnissen in Modellsystemen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine skalierbare, markierungsfreie Bildgebungstechnik, die an verschiedene biologische Modelle und Krankheitsbereiche angepasst werden kann.
Operationelle und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unklarheiten bei der Validierung von Zielstrukturen und Signalwegen.
- Operativer Wert: Verbessert die Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit von bildgebenden Workflows.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung über Fortführung oder Einstellung von Projekten sowie die Kapitalallokation, indem hochinformative, multiplexe Daten bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Entdeckungs- und präklinischen Programmen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in fortgeschrittener optischer Bildgebung und Integration multimodaler Hardware.
- Benötigt spezialisierte Instrumentierung, einschließlich abstimmbare Laser und synchronisierte Detektionssysteme.
- Erfordert die Standardisierung von Bildgebungsprotokollen und Datenanalyse-Pipelines über Teamgrenzen hinweg.
- Die Anpassung an verschiedene Modellsysteme kann eine Optimierung der Bildparameter und der Probenvorbereitung erfordern.
- Die Komplexität der Hardwareintegration und des Datenmanagements kann die Durchsatzrate in einigen Umgebungen begrenzen.
