Genomweite Analyse mittels ChIP zu Isoform-spezifische Gene-Targets zu identifizieren

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, genomische Zielstrukturen von KDM five a Jared one, einer RBB two-Histon-Demethylase, zu identifizieren. Dies wird erreicht, indem in einem zweiten Schritt vernetzte Chromatinpräparationen durch Beschallung in DNA-Fragmente geeigneter Größe zerschnitten werden. An RBB two gebundene DNA-Fragmente werden anschließend mittels RBB two-Antikörpern immunpräzipitiert.

Anschließend wird die gewonnene genomische DNA mittels PCR für die Sequenzierung amplifiziert. Schließlich werden die mittels Illumina sequenzierten kurzen Reads eindeutig gegen das humane Genom ausgerichtet, und signifikante Peaks werden identifiziert und den nächstgelegenen Genen zugeordnet. Um Rbbb zwei Zielgene zu identifizieren, werden Ergebnisse herangezogen, die molekulare Funktionen im Zusammenhang mit Rrb B zwei Zielgenen basierend auf der genomweiten Identifizierung von Rbbb zwei angereicherten Regionen zeigen.

Hallo, ich bin Mike. Sie aus dem Labor von Dr. Elizabeth Bencia am Department für Biochemie und Molekulargenetik an der Universität von Illinois in Chicago. Und ich bin ala aus dem Labor für Biomedizinische Genomik unter der Leitung von Dr. NGA am BARCEL Biomedizinischen Forschungspark der Universität PO P fea.

Und ich bin Danielle Dal. Und ich bin William Richter. Beide von uns befinden wir uns ebenfalls im Benevolence Skill Lab.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren für die Chromatin-Immunpräzipitation und Sequenzierung. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Bindungsstelle seines Dermatologen zu untersuchen. Beginnen wir also.

Um dieses Verfahren zu beginnen, züchten Sie etwa 10 hoch 8 Zellen für jede Immunpräzipitation oder IP. Hier: diffuses osteolytisches Lymphom.

U 9 37 Zellen werden verwendet und zur monozytären Differenzierung mit TPA für 96 Stunden induziert, gefolgt von Zellwachstum in Formaldehydlösung, die direkt dem Medium zugesetzt wird, um eine Endkonzentration von 1 % zu erreichen. Dann wird der Kolben kurz geschwenkt und 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Anschließend wird das Medium abgesaugt und die Zellen mit 15 Milliliter eiskalter PBS gespült. Dieser Waschschritt wird einmal wiederholt.

Fügen Sie anschließend sechs Milliliter Lysepuffer eins jedem der Kolben auf Eis hinzu. Schwenken Sie dann die Kolben 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Abschließend gewinnen Sie die Zellen mithilfe eines Zellabstreifers und überführen sie in 15-Milliliter-Konizgläser.

An diesem Punkt können die Zellen bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Falls die Zellen eingefroren wurden, tauen Sie sie auf. Nach dem Auftauen zentrifugieren Sie die Zellen und verwerfen den Überstand.

Suspenderen Sie die Zellen anschließend in sechs Millilitern Lysepuffer zwei und schwenken Sie die Röhrchen vorsichtig 10 Minuten bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie die Zentrifugation und resuspendieren Sie die Zellen in 2,5 Millilitern Lysepuffer drei. Bereiten Sie danach die Suspension zur Sonifikation vor, indem Sie sie in ein Becherglas mit eisgekühltem Wasser stellen und die Mikrotip eines Branson 450 Soniergeräts auf eine Amplitude zwischen 50 und 60 % einstellen.

Sonifizieren Sie die Lösung für eine 32. Sekunde mit kontinuierlichem Impuls und kühlen Sie sie auf Eis. Wiederholen Sie diese Impulse für eine Minute 10 bis 15 Mal, pipettieren Sie den Inhalt des Reaktionsgefäßes mehrmals auf und ab und überführen Sie ihn in ein neues Reaktionsgefäß. Fahren Sie fort, die Lösung in Impulsen zu behandeln und abzukühlen.

Fügen Sie nach der Sonikation zusätzlich fünfmal Triton X-100 10 % der Lösungsvolumens hinzu. Überführen Sie anschließend die Lysate in 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie das Zelltrümmer in einer Mikrozentrifuge, bevor Sie die Chromatin-Immunpräzipitation oder Chip durchführen. Bewahren Sie 50 Mikroliter des Zelllysats als Input-Probe auf.

Anschließend wurde das klare Zelllysat mit Dynabeads, die an einen zuvor gemäß der schriftlichen Anleitung präparierten Antikörper gebunden waren, kombiniert. Die Mischung zusammen mit der 50-Mikroliter-Eingangsprobe über Nacht bei vier Grad Celsius schütteln. Die Beads mit einem Milliliter Waschpuffer waschen.

Dann verwenden Sie einen Magnethalter, um die Kügelchen zu sammeln, und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diese Waschung sechs bis acht Mal. Führen Sie eine abschließende Waschung mit einem Milliliter TE-Puffer mit 50 Millimolar Natriumchlorid durch.

Zentrifugieren Sie die Kügelchen in einer Mikrozentrifuge; danach den restlichen TE-Puffer abpipettieren. Anschließend 100 Mikroliter Elutionspuffer zu den Proben hinzufügen. Unmittelbar danach.

Inkubieren Sie die Proben bei 65 Grad Celsius für 10 bis 15 Minuten. Kratzen Sie die Röhrchen alle zwei Minuten an einem 1,5-Milliliter-Röhrchenhalter ab, um die Perlen in Suspension zu halten. Sammeln Sie die Perlen mittels Zentrifugation und dem Magnethalter und überführen Sie das SNAT in ein PCR-Röhrchen.

Danach die zuvor aufbewahrte Input-Probe entnehmen und drei Volumina des Elutionspuffers hinzufügen. Abschließend die IP- und Input-Proben über Nacht bei 65 Grad Celsius in den Thermocycler geben. Um die Vernetzungen am folgenden Tag rückgängig zu machen, ein Volumen TE-Puffer zu den Proben hinzufügen.

Anschießend RNAs A bis zu einer Endkonzentration von 0,2 Mikrogramm pro Mikroliter hinzufügen. Die Proben im Thermocycler eine bis zwei Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation Proteinase K bis zu einer Endkonzentration von 0,2 Mikrogramm pro Mikroliter hinzufügen.

Anschließend die Proben zwei Stunden lang im Thermocycler bei 55 Grad Celsius inkubieren. Danach die Proben einmal mit einem Volumen Phenol extrahieren. Die Proben ein zweites Mal mit einem Volumen Phenyl-Chloroform-Isoamylalkohol extrahieren.

Extrahieren Sie die Proben abschließend nochmals mit einem Volumen Chloroform-Isoamylalkohol. Geben Sie dann 30 Mikrogramm Glykogen zu jeder Probe hinzu. Fügen Sie außerdem Natriumchlorid bis zu einer Endkonzentration von 0,2 Molar sowie zwei Volumina Ethanol zu den Proben hinzu.

Inkubieren Sie sie 30 Minuten bei minus 80 Grad Celsius. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Proben und dekantieren Sie das Überstand. Waschen Sie die Pellets mit 500 µL 75%igem Ethanol, trocknen Sie die Pellets anschließend und resuspendieren Sie sie in 40 µL Wasser.

Um die Größen der durch das SONICATION-Verfahren erzeugten DNA-Fragmente zu überprüfen, laden Sie fünf Mikrogramm der gereinigten Input-Probe in ein 1,8 %iges Agarosegel und führen das Gel durch. Das Sonication-Verfahren sollte Fragmente im Bereich von 150 bis 350 Basenpaaren erzeugen. Falls die Fragmente jedoch nicht in diesem Bereich liegen, sollte das Sonication-Verfahren angepasst werden, indem die Anzahl der Impulse und die Amplitude vor der Amplifikation der genomischen DNA variiert werden.

Überprüfen Sie Größe, Konzentration und Anreicherung der Proben, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Um die Amplifikation der genomischen DNA zu beginnen, entnehmen Sie 34 Mikroliter der IP-Probe und 200 Nanogramm der Input-Probe. Führen Sie die Endreparatur, A-Tailing und Ligation von Adaptern an DNA-Fragmente unter Verwendung eines Illumina-Genom-DNA-Probevorbereitungskits durch, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben.

Reinigen Sie die DNA mithilfe eines Mini-Elutions-PCR-Reinigungs-Kits und eluieren Sie sie anschließend in Puffer EB, der zuvor auf 50 Grad Celsius vorgewärmt wurde. Verwenden Sie 23 Mikroliter und 46 Mikroliter für die IP- und Input-DNA-Proben respectively. Stellen Sie die PCR-Reaktion durch Zugabe von 23 Mikrolitern DNA mit Adaptern und 25 Mikrolitern Fusion-DNA-Polymerase aus dem Kit her.

Ein Mikroliter 20 Mikromolarer PCR-Eins und ein Mikroliter 20 Mikromolarer PCR-Zwei; führen Sie die PCR-Reaktion wie in dem schriftlichen Protokoll beschrieben durch. Reinigen Sie die DNA mit dem Qiagen Mini-PCR-Reinigungskit.

Erwärmen Sie 15 Mikroliter Puffer EB auf 50 Grad Celsius vor und verdünnen Sie die DNA, indem Sie 0,5 Mikroliter der Probe im Verhältnis 1:4 verdünnen, und führen Sie eine NanoDrop-Messung durch, um die amplifizierten Produkte zu reinigen. Bereiten Sie ein 1,8 %iges Agarosegel von 50 Milliliter mit HPLC-Reinstwasser vor, fügen Sie TAE und Bromid hinzu, nachdem die Agarose geschmolzen ist. Gießen Sie dann das Gel ein und laden Sie das Gel auf.

Nachdem vier Mikroliter Lade-Puffer zu den Input- und IP-Proben hinzugegeben wurden, führen Sie das Gel bei 120 Volt 45 Minuten lang laufen. Analysieren Sie das Gel nach dem Lauf. Dies sollte zeigen, dass Fragmente im Bereich zwischen 150 und 350 Basenpaaren erzeugt wurden.

Sie repräsentieren genomische DNA-Fragmente mit einer Länge zwischen 50 und 250 Basenpaaren. Schneiden Sie mit einem Skalpell den Gelbereich aus, der das Material im Bereich von 150 bis 350 Basenpaaren enthält. Achten Sie darauf, den Adapter-Adapter-Band, der bei etwa 120 Basenpaaren läuft, nicht mit auszuschneiden.

Isolieren Sie die DNA mithilfe eines Kayak-Schnell-Gel-Extraktionskits gemäß den Herstelleranweisungen. Trocknen Sie die Probe in einem SpeedVac ohne Hitze exakt auf 11 Mikroliter ein. Entnehmen Sie ein Mikroliter der Probe und bestimmen Sie die DNA-Konzentration mit einem NanoDrop-Spektrophotometer.

Schließlich identifizieren Sie angereicherte Genprodukte mithilfe des Illumina-Genomanalysators und analysieren Sie die Bindungsstellen und Zielgene, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Die genomischen Koordinaten der identifizierten angereicherten RB-Bindungsprotein-zwei- oder RBP-zwei-Bindungsregionen werden in einem chromosomenspezifischen Format dargestellt. Die Besetzungen von Ensemble-Genen auf den Chromosomen können als schwarze VARs visualisiert werden.

Hier werden die Besetzungen des Chromosoms 10 durch RBP zwei gezeigt, wobei zwei Bindungsregionen als vertikale Linien dargestellt sind. Das mittlere Feld zeigt alle Bindungsregionen der RBP-zwei-Isoformen auf Chromosom 10, und das untere Feld zeigt die Bindungsregionen der großen RBP-zwei-Isoform. Diese Informationen geben einen Überblick über überlappende und spezifische Besetzungen der RBP-zwei-Isoformen auf Chromosom 10.

Hier ist eine Wärmekarte mit falscher Entdeckungsrate oder FDR-korrigierten, signifikant angereicherten Genontologie- oder GO-molekularen Funktionskategorien unter den von RBP gebundenen Genen dargestellt. Zwei Farbtöne in Richtung Rot deuten auf hohe statistische Signifikanz hin. Gelb zeigt geringe statistische Signifikanz an, und Grau weist auf keine statistische Signifikanz hin.

Die Anreicherungsanalyse zeigt die überlappenden und isoformspezifischen molekularen Funktionen der Zielgene von R BP zwei. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen während dieses Verfahrens identifiziert. Es ist wichtig, DNA-Fragmente im geeigneten Größenbereich und mit ausreichender Ausbeute herzustellen.

Dies kann erreicht werden, indem Sie unsere Anleitungen während des SCHOCKIERENS-Schritts befolgen. Das war's. Viel Erfolg bei Ihren Experimenten und danke fürs Zuschauen.