A Novel Bayesian Change-Punkt Algorithmus für genomweite Analyse Diverse ChIPseq Datentypen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Dichte der zugeordneten Lesepositionen aus Chromatin-Immunpräzipitationssequenzierungsdaten zu nutzen, um die posteriore mittlere Lese-Dichte über das gesamte Genom zu schätzen. Dies wird durch eine Vorverarbeitung erreicht, bei der die zugeordneten ChIP-seq-Lesungen in blockierte Dichteprofile umgewandelt werden, wobei die gleiche Anzahl an Lesungen innerhalb von 200 Basenpaar umfassenden, sich nicht überlappenden Fenstern liegt.

Im zweiten Schritt werden benachbarte Bins mit gleicher Dichte zu einem größeren Block zusammengefasst; anschließend werden die posterioren mittleren Dichten jedes Blocks rekursiv im Kontext aller umgebenden Blöcke mithilfe eines Bayes-Modells mit Vorwärts- und Rückwärtsfiltern berechnet. Dabei wird die Read-Anzahl für einen Block mit einer Poisson-Verteilung modelliert, deren Theta-Parameter eine Gamma-A-priori-Verteilung mit Alpha- und Beta-Parametern annimmt. Danach werden die posterioren Schätzungen der mittleren Dichte jedes Blocks daraufhin überprüft, ob sie bezüglich der Eingabekontroll-Hintergrunddichte das 90. Quantil überschreiten, um die endgültigen angereicherten Genomsegmente zu ermitteln. Die erhaltenen Ergebnisse veranschaulichen den Fortschritt von rohen sequenzierten Reads über die Schätzungen der posterioren mittleren Read-Dichten hin zu angereicherten Inseln in ChIP-seq-Daten während der BCP-Analyse.

Außerdem zeigen die Ergebnisse, dass BCP ein konkurrierendes Werkzeug namens cer übertrifft. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie CER liegt darin, dass BCP die neuesten Fortschritte bei versteckten Markov-Modellen nutzt und somit die Feinheiten der ChIP-seq-Datenanalyse besser charakterisiert als frühere heuristische Methoden. Diese Methode kann bei zentralen Fragestellungen im Bereich der Epigenomik helfen, beispielsweise bei der Aufklärung der Rolle von Histonmodifikationen durch die Beschreibung ihrer genomweiten Anreicherungsmuster.

Obwohl diese sorgfältige Methode Einblicke in die Analyse von ChIP-seq-Daten ermöglichen kann, lässt sich der grundlegende Ansatz ebenso auf die Analyse anderer Next-Generation-Sequenzierungsdaten anwenden, beispielsweise auf die Identifizierung differentiell methylierter Regionen in Bis-Sufi-Sequenzierungsdaten, neuartiger Transkriptionsorte in RNA-Seq, Kopienzahlvariationen oder zahlreiche Mikroarray-Tiling-Datensätze. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend für das klare Verständnis der Methodik und ihrer Vorteile. Die theoretischen Vorteile liegen im Software-System verborgen.

Alle hier gezeigten Verfahrensschritte wurden in einem einzigen ausführbaren Programm innerhalb des BCP-Softwarepakets zusammengefasst, das in diesem Video zum Download verfügbar ist. Die vom Programm ausgeführten Schritte werden beschrieben, um die Software auszuführen. Drei Parameter sind erforderlich.

Eine Datei mit eindeutig zugeordneten Reads aus einer Chip-Probe und eine ähnliche Datei für Input-Kontroll-Reads sowie ein Ausgabedateiname, um Eingabedateien für die BCP-Analyse vorzubereiten. Ordnen Sie zunächst die kurzen Reads, die aus Sequenzierläufen stammen, mithilfe der bevorzugten Software für die Alignment-Kurzread-Abbildung dem entsprechenden Referenzgenom zu. Die zugeordneten Positionen sollten in das sechsspaltige, browsererweiterbare Datenformat (BED) umgewandelt werden, wobei jede tabulatorgetrennte Zeile einen zugeordneten Read angibt, einschließlich der zugeordneten Chromosom-Startposition, Endposition, des Read-Namens, des Scores und des Strangs.

Verlängern Sie die Chip- und Eingabekartenpositionen auf eine vorbestimmte Fragmentlänge. Zum Beispiel die Fragmentgröße, die während des enzymatischen Verdauens oder der Sonifikation der DNA angestrebt wird, üblicherweise etwa 200 Basenpaare. Anschließend werden die Fragmentanzahlen in benachbarten Bins zusammengefasst.

Standardmäßig ist die Bin-Größe auf die geschätzte Fragmentlänge von 200 Basenpaaren eingestellt. Jede mögliche Änderungsstelle in einer Gruppe von Bins mit identischen Lesezahlen liegt höchstwahrscheinlich an den äußersten Grenzen. Demzufolge ist es unwahrscheinlich, dass eine Änderungsstelle an einer inneren Grenze zwischen zwei Bins mit denselben Lesezahlen auftritt.

Daher gruppieren Sie benachbarte Bins mit identischen Reads pro Bin zu einem einzigen Block zusammen. Nachdem die Eingabedateien vorbereitet wurden, rufen Sie die BCP-Schätzung auf, indem Sie einfach den am unteren Bildschirmrand angezeigten Befehl eingeben. Die Read-Dichte jedes Blocks wird als Poisson-Verteilung mit einem Mittelparameter Theta modelliert, der einer Mischung aus Gamma-Verteilungen mit Alpha- und Beta-Parametern sowie einer A-priori-Wahrscheinlichkeit für das Auftreten eines Change Points in einem beliebigen Block folgt.

Die Begrenzung von P, die jeden Block auf diese Weise bedingt, führt effektiv zu einem unendlichen Zustand versteckten Markov-Modell oder HMM. Die Hyperparameter Alpha, Beta und P werden mittels maximaler a-posteriori-Wahrscheinlichkeit geschätzt. Die Bayes-Schätzungen werden für jeden Block Theta_T explizit als Erwartungswert von Theta_T gegeben Y_T berechnet; die traditionelleren, aber zeitaufwändigen Vorwärts- und Rückwärtsfilter, die häufig in HMS verwendet werden, werden durch die rechentechnisch effizientere beschränkte Mischungsapproximation mit begrenzter Komplexität zur Schätzung der a-posteriori-Mittelwerte Theta_Dach_T ersetzt. Die resultierenden a-posteriori-Mittelwerte werden zu einem näherungsweisen stückweise konstanten Profil geglättet, sodass Blöcke mit identischem Theta_Dach_T weiter zusammengefasst werden sollten, wobei die Grenzkoordinaten aktualisiert werden.

BCP verwendet die Anzahl der Eingabe-Lesevorgänge pro Block als Hintergrundrate und bestimmt die Anreicherung. Mithilfe eines einfachen Hypothesentests wird geprüft, ob die mittlere Dichte der Chip-Position für einen Block einen bestimmten Signifikanzschwellenwert überschreitet. Das 90. Perzentil ist der Standardschwellenwert und in den meisten Fällen geeignet.

BCP fusioniert anschließend benachbarte Blöcke der posterioren mittleren Dichte, die die Anreicherung überschreiten, zu einer einzigen Region zusammen und meldet die fusionierten Koordinaten im Browser. Das erweiterbare Datenformat BCP eignet sich hervorragend zur Identifizierung von Regionen mit breiter Anreicherung in Daten zu Histonmodifikationen. Hier werden BCP-Ergebnisse mit denen von cser verglichen, einem bestehenden Werkzeug, das in früheren Arbeiten dieses Labors eine starke Leistung gezeigt hat. Untersuchungen zur H-drei-K-36-Trimethylierung zeigten eine Tendenz zu deutlich größeren Inselgrößen bei BCP im Vergleich zu cer.

Größere Inseln entsprechen eher der herkömmlichen Erwartung breiter, diffuser Anreicherungen der H3K36-Trimethylierung. Größere Inseln allein deuten jedoch nicht auf Genauigkeit hin. Daher wurde die bekannte Assoziation von H3K36-Trimethylierungsinseln mit aktiv transkribierten Genabschnitten sowie deren gegenseitige Ausschließlichkeit gegenüber H3K27-Trimethylierungsinseln genutzt, um die Leistung von BCP und CER im Vergleich zu CER zu bewerten. BCP rief größere, zusammenhängende Inseln auf, die Genabschnitte besser erfassen, ohne dabei eine erhöhte Überlappung mit H3K27-Trimethylierungsinseln in Kauf zu nehmen.

BCP bewahrt die hohe Überschneidung aktiver Gene durch H3K36-Trimethylierungs-Inseln aufrecht, wobei die Grenzen eng an die Genkörper angepasst sind, ohne den Grad falsch positiver Überschneidungen mit intergenischen Bereichen oder Genen mit unterdrückter Transkription oder dem reprimierenden H3K27-Trimethylierungs-Markierung zu erhöhen. Bei der Bewertung der Reproduzierbarkeit der BCP-Insel-Aufrufe in zwei replikativen Datensätzen zeigte sich, dass BCP im Gegensatz zu dem konkurrierenden Algorithmus Cser nicht stark von der Tiefe der Read-Abdeckung abhängt. Weitere Belege für die Robustheit und Reproduzierbarkeit von BCP liefern die Untersuchung zusätzlicher, unterschiedlicher Regionen, die konsistente Inselgrenzen trotz verringerter Abdeckungstiefe aufzeigen. Um die Vielseitigkeit von BCP vollständig zu demonstrieren, wurde ein breites Spektrum an Daten zu Histonenmodifikationen herangezogen, darunter die punktförmigen Markierungen H3K27-Acetylierung, H3K9-Acetylierung und H3K4-Trimethylierung sowie die diffusen Markierungen H3K9-Trimethylierung, zusätzlich zu H3K27-Trimethylierung und H3K36-Trimethylierung. Diese Datensätze wurden mit den Standardparameter-Einstellungen sowohl für BCP als auch für Cser analysiert.

Im Zentrum befindet sich die Anreicherung von H3K36-Trimethylierung am PXDN-Gen, die aktive Transkription markiert. Erwartungsgemäß am Transkriptionsstartpunkt liegen die zusätzlichen punktförmigen Aktivmarkierungen H3K27-Acetylierung, H3K9-Acetylierung und H3K4-Trimethylierung. Direkt downstream von PXDN befindet sich ein reprimierter intergener Bereich, markiert durch Anreicherung von H3K27-Trimethylierung. Auf der gegenüberliegenden Flanke liegt ein durch H3K27-TRIMETHYLYRIERUNG reprimiertes Gen. Ein weiteres Stück weiter außen.

Unser stillgelegtes Chromatin, gekennzeichnet durch das Vorhandensein einer Anreicherung der H3K9-Trimethylierung, scheint die Stilllegung von SN TG zwei und MYT ein L anzudeuten, möglicherweise in einer weniger flüchtigen Weise als die H3K27-Trimethylierungs-Repression. Dieser Bereich umfasst den Großteil der bei ChIPseek bei histonellen Modifikationen beobachteten Phänomene. Er veranschaulicht, wie die dynamische Natur von BCP sowohl punktförmige Acetylierungen als auch H3K4-Trimethylierungsmarkierungen erkennen kann, während gleichzeitig große zusammenhängende Inseln der H3K27-Trimethylierungs- und H3K9-Trimethylierungs-Repression sowie die H3K36-Trimethylierung aktiver Transkription unterschieden werden.

Dieser Algorithmus kann je nach Anzahl der Reads und den Ergebnissen der Genomzeichen ungefähr 30 Minuten dauern. Im Gegensatz zu vielen anderen Methoden ist keine nennenswerte Optimierung nach diesem Verfahren erforderlich. Mithilfe von BBCP können zahlreiche verschiedene Zielproteine der Chromatin-Immunpräzipitation untersucht werden, einschließlich verschiedener weiterer Histonmodifikationen sowie DNA-bindender Transkriptionsfaktoren, um zusätzliche Fragen zu epigenomischen Mechanismen und der Genregulation zu beantworten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie BCP verwendet wird, um Regionen zu identifizieren, die in der ChIP-seq-Datenanalyse für diffuse Histonmarkierungen zugänglich sind.