Patch Clamp Messungen von Mouse Netzhautneuronen in einem Dark-Scheiben angepasst Vorbereitung

Unsere visuelle Wahrnehmung beginnt damit, dass der Sehpigment in den Fotorezeptoren unserer Netzhaut Photonen von Lichtenergie absorbiert, was letztendlich zur Schließung zyklischer, nukleotidgesteuerter Kanäle in der Zellmembran führt. Dies unterdrückt die Freisetzung des Neurotransmitters Glutamat sowohl aus Stäbchen als auch aus Zapfen. Das freigesetzte Glutamat wird von nachgeschalteten Netzhautzellen erfasst, um die nachgeschalteten Signale zu untersuchen.

Die Augen werden von einer euthanasierten Maus entfernt. Die S werden isoliert, in einen Agarblock eingebettet und mit einem vibrierenden Mikrotom geschnitten. Anschließend werden die Netzhautschnitte unter ein Mikroskop gelegt und mit LED-Beleuchtung stimuliert.

Während Patch-Clamp-Aufnahmen durchgeführt werden, um die erzeugten synaptischen Ströme oder Potenziale zu messen, werden Anfänger normalerweise Schwierigkeiten haben, da die Arbeit im Dunkeln zusätzliche Komplexität mit sich bringt. Daher vermittelt die Möglichkeit, den gesamten Prozess zu visualisieren, ein Gefühl, das sich andernfalls nur schwer beschreiben lässt.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die zur Aufzeichnung und als Referenz verwendeten Drahtelektroden mit einer Schicht aus Silberchlorid beschichten. Tauchen Sie die Elektroden in einmolares Natriumchlorid. Verwenden Sie dann eine 15-Volt-Stromquelle mit einer Sinuswelle von einem Hertz, um etwa 20 Sekunden lang 15 Volt zwischen ihnen anzulegen.

Stellen Sie mit einem Mikropipettenzuggerät Patch-Pipetten aus feinpoliertem BO-Silikaglas her und wählen Sie einen Pipettenspitzenwiderstand entsprechend der Größe der Zielzellen, wobei für Zellkörper mit einem Durchmesser von etwa 20 Mikrometern ein Widerstand zwischen fünf und zehn Megaohm verwendet wird. Für Zellkörper mit einem Durchmesser von etwa fünf Mikrometern verwenden Sie einen Spitzenwiderstand von 12 bis 15 Megaohm.

Um die Masselektroden herzustellen, füllen Sie mit einer Spritze Polyethylen-Schlauch mit einer 3,5 %igen Agar-Lösung, die in einkommaeiner Millimolar-Natriumchloridlösung hergestellt wurde. Bereiten Sie anschließend die folgenden Lösungen gemäß den Anweisungen im beiliegenden schriftlichen Protokoll vor: äußere Badlösung, Schneidelösung, pipetteninterne Lösung mit Kaliumaspartat und der Agar-Stopper.

Lagern Sie alle Lösungen bei vier Grad Celsius, bis sie benötigt werden. Am Tag des Experiments pipettieren Sie etwa 1,5 Milliliter Kaliumaspartat-Innenlösung. Geben Sie dann verdünntes Fluor hinzu.

Geben Sie etwa 50 Milliliter AIMS-Medium mit Natriumbicarbonat in einen lichtundurchlässigen Vorratsbehälter. Schließen Sie den Kunststoffschlauch an einen Gastank mit 5 % Kohlendioxid und 95 % Sauerstoff an, um das AIMS-Medium mit dem Gas zu equilibrieren, und stellen Sie den Behälter anschließend in ein Wasserbad mit einer Temperatur von 30 bis 32 Grad Celsius. Füllen Sie danach eine Flasche mit 110 Millilitern AIMS-Medium, das die HEPEs enthält, und stellen Sie sie auf Eis.

Äquilibrieren Sie das Medium, indem Sie die Lösung mit 100 % Sauerstoffgas durchbläsen. Geben Sie das verbleibende aimes-Medium, das Natriumbicarbonat enthält, in ein beheiztes Reservoir auf dem Faraday-Käfig. Wickeln Sie Parafilm um Schlauch und Flaschenverschluss, um das Gas im Raum über der Lösung einzuschließen und mit 5 % Kohlendioxid und 95 % Sauerstoffgas zu äquilibrieren.

Unter Verwendung eines Glas-Luftverteilrohrs wird 3 % Agarose mit niedriger Gelier-Temperatur hergestellt, indem 0,75 Gramm in 25 Milliliter AIMs-Medium unter starker Hitze zugegeben werden. Die Lösung beträgt etwa 115 Grad Celsius während des Rührens. Sobald die Lösung blasenfrei klar wird, wird die geschmolzene Agarose-Lösung in ein Wasserbad von 42 Grad Celsius gegeben.

Richten Sie die Aufnahmekammer auf dem inversierten Mikroskop ein. Schieben Sie eine fünf Zentimeter lange Agarbrücke über die Silber-Silberchlorid-Referenzelektrode und positionieren Sie sie in der Aufnahmekammer. Der Pipettenspitzenwiderstand kann gemessen werden, indem man eine Pipette mit der internen Lösung füllt, sie auf dem Pipettenhalter platziert, den Pipettenhalter in die Verstärkerkopfstufe einsetzt und die Pipette in die Lösung absenkt. Um das visuelle Pigment für physiologische Ableitungen zu erhalten, sollten alle Arbeitsschritte unter Infrarotlicht unter Verwendung von Infrarotbrillen durchgeführt werden, doch hier werden alle Schritte unter Raumlicht gezeigt.

Nachdem die Maus euthanasiert wurde, entfernen Sie mit einer gebogenen Schere schnell die Augen. Legen Sie die Augen auf ein Stück Filterpapier, um ein Wegrollen zu verhindern. Halten Sie dann ein Auge mit einer Pinzette fest und machen Sie mit einer dünnen beidseitigen Klinge einen Einschnitt in die Hornhaut.

Sobald der Augapfel durchstochen ist, überführen Sie das Auge in eine 60 Millimeter große Petrischale, die mit AIMs-Medium gefüllt ist. Benutzen Sie den Schlitz in der Hornhaut als Einstiegspunkt und schneiden Sie mit einer kleinen Schere die restlichen Teile der Hornhaut weg.

Entfernen Sie dann die Linse und den Glaskörper, wobei sichergestellt werden muss, dass die Netzhaut am Augenbecher angeheftet bleibt. Legen Sie ihn in einen lichtdichten Behälter, der mit AIMSMedium gefüllt ist, das mit 5 % Kohlendioxid in 95 % Sauerstoff bei 32 Grad Celsius äquilibriert wurde.

Schneiden Sie als Nächstes eine halbe Schnittmenge eines der Augenbecher mit einer Skalpellklinge Nummer 10. Lösen Sie die Netzhaut vom retinalen Pigmentepithel ab.

Entfernen Sie die Ränder der Netzhaut, um dem Gewebe zu ermöglichen, flach zu liegen. Verwenden Sie eine kleine Glas-Pasta-Pipette mit einem Latexballon, um eine 35-mm-Petri-Schale mit geschmolzenem Agar mit niedriger Geliertemperatur zu füllen, und ziehen Sie die Pinzette durch den Agar, um dessen Konsistenz zu prüfen. Sobald der Agar zu erstarren beginnt, übertragen Sie die Netzhaut auf die Oberfläche des Agars.

Danach mit einem verdrehten Stück Kimwipe die überschüssige Flüssigkeit rings um die Netzhaut aufnehmen, ohne diese zu berühren. Weitere zwei bis drei Tropfen Agar direkt auf die Netzhaut geben und schnell einen Plastikzylinder daraufsetzen, um eine Wand darum zu bilden, wobei die Netzhaut nahe dem Zentrum des Zylinders gehalten wird; zusätzlichen geschmolzenen Agar tropfenweise hinzufügen, die Petrischale anschließend zur Abkühlung in ein Eiswasserbad überführen. Nach 30 Sekunden das Gewebe entfernen und einen Kolben verwenden, um den Agarblock herauszudrücken, wobei vom dem Netzhaut am weitesten entfernten Ende gedrückt wird.

Verwenden Sie eine einseitige Rasierklinge, um einen kleinen Agarblock, der die Netzhaut enthält, auszuschneiden, und kleben Sie den Block mit Sekundenkleber an der Agar-Anschlagplatte auf der Probenscheibe fest. Übertragen Sie die Probenscheibe auf den Vibrationsmikrotomtisch und füllen Sie kalte ACSF-Lösung in den Tisch, sodass der Block mit der Netzhaut vollständig untergetaucht ist. Schneiden Sie Netzhautschnitte mit einer Dicke von etwa 200 µm, wobei die maximale Schwingfrequenz der Klinge verwendet wird und die Vorschubgeschwindigkeit der Klinge so eingestellt ist, dass der Schnitt durch die Netzhaut vier bis fünf Sekunden dauert. Einmal.

Verwenden Sie eine Skalpellklinge der Größe 11, um jeden verwendbaren Schnitt nacheinander aus dem Block zu schneiden. Legen Sie die Schnitte, die die Netzhaut enthalten, in die Ableitungskammern und befestigen Sie sie. Verwenden Sie zum Halten der Schnitte die Nylonfäden, die über den Slicehalter verlaufen.

Halten Sie das Agar um die Netzhaut herum fest, sodass die Netzhaut unbehindert bleibt. Für die Ableitungen. Bringen Sie die Ableitkammer auf den Objekttisch des aufrechten Mikroskops.

Schließen Sie den Vorhang und schalten Sie die Infrarotlichtquelle ein, um den Schnitt mit einer auf Infrarot empfindlichen Kamera zu betrachten. Identifizieren Sie unter dem Mikroskop einen Netzhautschnitt mit intakten Photorezeptoren im geeigneten Schneidewinkel. Aufgrund des Schneidvorgangs können geringfügige Oberflächenschäden sichtbar sein.

Entfernen Sie mit einer Pipette mit abgebrochener Spitze vorsichtig die toten Zellkörper. Um diese dünne Zellschicht zu entfernen, sobald eine gesunde Schicht lebender Zellen sichtbar ist, identifizieren Sie einen Zellkörper, dessen Position in der gewünschten Schicht liegt. Bewegen Sie die Pipettenspitze so, dass sie die Zellmembran eindellt, und üben Sie sanften negativen oder nach innen gerichteten Druck aus, um eine hochwiderständige Dichtung zu erzeugen. Der Ganzzellmodus kann erreicht werden, indem negativer Druck auf die Elektrode ausgeübt wird, um in die Zelle einzudringen.

Als Nächstes stimulieren Sie das Netzhautgewebe mit Licht unter Verwendung von LEDs, um Antworten hervorzurufen. Am Ende der Aufzeichnung erfassen Sie ein Bild mit dem geeigneten Anregungslicht für den Fluor, der aus der intrapipettären Lösung in die Zelle dialysiert ist. Hier sind lichtinduzierte Potentiale eines dunkeladaptierten Netzhautneurons auf Lichtblitze zunehmender Stärke dargestellt.

Diese Abbildung ist ein Fluoreszenzbild, das von einem Netzhautschnitt aufgenommen wurde, bei dem die Zellen mit dem Farbstoff Lucifer Yellow gefüllt wurden; die hervorgerufene Fluoreszenz zeigt die Morphologie der Zellen, von denen aus Patch-Aufzeichnungen durchgeführt wurden. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein besseres Verständnis für einige der Komplexitäten gewinnen, Patch-Clamp-Aufzeichnungen von dunkeladaptierten Netzhautschnitten anzufertigen. Ziel dieses Verfahrens ist es, lichtinduzierte Antworten unter kontrollierter Beleuchtung zu messen.

Um dies zu erreichen, müssen wir zunächst die Netzhaut isolieren, sie in Agar einbetten und anschließend Netzhautschnitte herstellen, aus denen wir Einzelzellableitungen vornehmen können.