Patch-Clamp Kapazitätsmessungen und Ca ^{2 +} Imaging bei Single Nervenendigungen in Retinal Slices

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Agar-eingebettete Netzhautschnitte für die Untersuchung der mikroskopischen Schaltkreise in den präsynaptischen Nervenendigungen der Bipolarzellen vorzubereiten. Dies wird erreicht, indem zunächst die Netzhaut aus einem dunkeladaptierten Goldfischaugen entnommen und ein kleines rechteckiges Stück dieser Netzhaut ausgeschnitten wird. Das Netzhautstück wird dann in eine transparente Agarlösung mit niedrigem Schmelzpunkt eingetaucht, die anschließend in einer gut gekühlten Schnittlösung verfestigt wird.

Der nächste Schritt besteht darin, den festen Agarblock, der das rechteckige Stück Retina enthält, mit einem Vibratom mithilfe von Schneidvibratoren zu zerschneiden. Der letzte Schritt ist die Visualisierung, Identifizierung und Anlage einer Patch-Clamp-Messung. Klemmen Sie einen Nervenendapparat einer bipolaren Zelle.

Letztlich zeigen die Ergebnisse den präsynaptischen Kalziumstrom und die physikalische synaptische Exozytose, gemessen anhand der Membrankapazität in atomisierten und intakten bipolaren Zellendigungen. Hallo, mein Name ist Han Kim. Ich bin Postdoktorand im PCO-Labor am Burham-Institut.

Heute werde ich die AGA-eingebettete Schnittpräparation der kalten Netzhaut des Gesichts vorstellen und die Patch-Clamp-Kapazitätsmessung an einer einzelnen Pipeline demonstrieren. Um dieses Verfahren zu beginnen, isolieren Sie jedes Auge eines Goldfisches, indem Sie mit einer Feder-Schere gleichmäßig um die Vorderseite des Auges schneiden. Anschließend werden die Augentassen in gekühlter Schnittlösung ohne Calcium platziert.

Falls erforderlich, die Linse mit einer Pinzette entfernen. Anschließend das an der Netzhaut befestigte Pigmentepithel entfernen, indem man die Netzhaut mit einer feinen Pinzette mit 45-Grad-Spitze vom Augenbecher ablöst. Danach den Sehnerv entweder mit einer feinen Pinzette oder einer Feder-Schere durchtrennen.

Anschließend Saugwirkung mit einer modifizierten Pasteurpipette oder einer Transferpipette mit großer Spitze ausüben. Um die Netzhaut zu entfernen, vorsichtig den restlichen, mit der Netzhaut verbundenen Pigmentepithel entfernen. Die Oberfläche der gereinigten und gesunden Netzhaut sollte glatt erscheinen.

Dann die isolierte Netzhaut etwa 15 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 0,03 % höherer IDE behandeln. Um das Glaskörper zu entfernen, beachten Sie, dass der Eingriff bei schwachem Licht durchgeführt werden sollte. Im nächsten Schritt ein rechteckiges Stück Netzhaut von etwa zwei mal zwei Millimetern ausschneiden, das die volle Dicke der Netzhaut enthält, indem die gewölbten Ränder mit einer Rasierklinge entfernt werden.

Überführen Sie dann das Netzhautstück in einen kleinen Behälter mit Agar-Lösung und versuchen Sie, die Menge der Lösung um die Netzhaut herum zu minimieren, während es in die flüssige Agar-Lösung gegeben wird. Anschließend tauchen Sie die Netzhaut mit dem Agar direkt in die eiskalte Schnittlösung, um den Agar zu verfestigen. Danach schneiden Sie den festen Agarblock, der das rechteckige Netzhautstück enthält, zu einem Würfel mit einer Kantenlänge von je einem Zentimeter (1 × 1 × 1 cm).

Kleben Sie den Block auf die Oberfläche der Schneideplatte in der vorgekühlten Schneidekammer. Anschließend schneiden Sie den Block in der eiskalten Schnittlösung in Schnitte mit einer Dicke von 200 bis 250 Mikrometern. Mithilfe eines Vibratoms können insgesamt fünf bis zehn Schnitte gewonnen werden, die etwa fünf bis sechs Stunden lang vital bleiben.

Überführen Sie danach eine der Schnitten in die Aufnahmekammer. Platziere einen U-förmigen Platinrahmen mit einem Netz aus Nylonfäden auf der Schnitte. Perfundieren Sie die Schnitte kontinuierlich mit einer Geschwindigkeit von ein bis zwei Milliliter pro Minute mit Aufnahmelösung, die mit Carbogen gesättigt ist.

Verwenden Sie in diesem Schritt eine Spritze mit einem 0,2-Mikron-Filteraufsatz, um die Glas-Patch-Pipette mit der internen Lösung bis zu einer Höhe von ein bis zwei Zentimetern vom hinteren Ende der Pipette zu füllen. Entfernen Sie anschließend Luftblasen aus der Spitze. Befestigen Sie die Pipette sicher im Halter.

Üben Sie positiven Druck auf die Pipette aus und bewegen Sie sie mithilfe eines Mikromanipulators in Richtung des angestrebten Endbereichs, während Sie die Spitze durch das Schnittpräparat nach unten führen. Bewegen Sie die Pipette seitlich im Schwenkmodus, um sicherzustellen, dass das Schnittpräparat nicht zusammen mit der Spitze gezogen wird. Bewegen Sie anschließend die Pipettenspitze um das Endstück herum, um die Membranoberfläche zu reinigen.

Drücken Sie die Pipettenspitze abwärts gegen den Rand des Terminals, um eine Vertiefung zu erzeugen und den positiven Druck zu entlasten. Wenn sich unmittelbar kein Gigaohm-Siegel bildet, wenden Sie leichten Unterdruck an die Pipette an. Sobald sich ein Gigaohm-Siegel gebildet hat, schalten Sie den E PC nine Patch-Clamp-Verstärker in den Onsell-Aufnahmemodus und stellen das Haltepotential auf minus 60 oder minus 70 Millivolt um.

Wenden Sie die schnelle Kapazitätskorrektur an und warten Sie, bis sich der Verschluss zwischen fünf und zehn Gigohm stabilisiert hat. Dann durchbrechen Sie die Membran mit scharfem, sanftem Sog. Um die Ganzzell-Aufnahmekonfiguration herzustellen.

Sie können auch Mundabsaugung anstelle einer Spritze verwenden. Nachdem die Ganz- Zell- Konfiguration an einem atomisierten MB- Terminal hergestellt wurde, applizieren Sie eine 200 Millisekunden dauernde Depolarisationsschritt von minus 70 auf null Millivolt. Beachten Sie, dass eine zwei Kilohertz hohe Sinuswelle im Spannungs-Klemm-Modus vor und nach dieser Depolarisation angelegt wird, um die Membrankapazität zu messen. Die Depolarisation ermöglicht die direkte Messung der durch die Öffnung spannungsabhängiger L- Typ- Kalziumkanäle ausgelösten einwärts gerichteten Kalziumströme mit einer auf Cäsium basierenden intrazellulären Lösung.

Gleichzeitig kann man den Kapazitätsanstieg verfolgen, der durch die kalziumabhängige Exozytose synaptischer Vesikel verursacht wird und die Membranfläche vergrößert. Wenn eine intakte MB-Bipolarzelle über die synaptische Endigung angepatcht wird, sind aufgrund der großen Leckströme, die durch die Gap-Junction-Kopplung in den Dendriten der MB-Bipolarzellen entstehen, keine erkennbaren Kalziumströme zu beobachten. Stattdessen zeigt sich ein großer, leckstromähnlicher Auswärtsstrom.

Es ist jedoch weiterhin möglich, den Kapazitätssprung mithilfe eines hochfrequenten sinusförmigen Reizes zu überwachen, der vor und nach dem dargestellten depolarisierenden Schritt aktiviert wird. Hier sind Beispiele von I-R-D-I-C, Aufnahmen von M-Bipolarzell-Terminale. Die intakten Terminale erscheinen eher elliptisch, wie in A und B gezeigt, während C das gemischte Terminal zeigt, das rund und kreisförmig erscheint.

Die Farbstoff-Füllmethode kann auch zur Klassifizierung der Zellendigungen verwendet werden. Hier sind Beispiele für Fluoreszenzbilder der MBI-Bipolarzellendigungen mit einem intakten Axon in D, einem teilweise durchtrennten Axon in E und einem vollständig entfernten Axon in F. Ihre Teria werden durch die blauen Pfeile angezeigt. Hier sind direkte Messungen von Calcium-Bildgebungssignalen, Exozytose und inhibitorischem Feedback dargestellt.

In einem MB-bipolaren Zellterminal wurde eine vorübergehende Anstiegsphase der Calciumkonzentration in den Teleria des MB-Terminals durch eine Spannungsclamp-Schrittdenolarisation ausgelöst; die entsprechende Fluoreszenzbildgebung der MB-Teleria ist in B zu sehen. Beispiele für kurzzeitige synaptische Depression der Neurotransmitterfreisetzung sind in C dargestellt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist darauf zu achten, die Menge an Lösung um die Retina herum so gering wie möglich zu halten, wenn diese in den Agarblock eingebracht wird. Dies verbessert die Anheftung der aus dem Agarblock herauswachsenden Strukturen.