Electroeluting DNA-Fragmenten

Hallo. Heute zeigen wir Ihnen, wie die Elektroelution durchgeführt wird, um DNA-Fragmente wie Verdauungs- und PCR-Produkte zu reinigen. Für weitere Anwendungen wie das Klonen und Sequenzieren kann die Elektroelution eine Methode der Wahl sein. Aufgrund der negativen elektrischen Ladung der DNA wird eine hohe Zellbarriere im elektrischen Feld platziert, wodurch die Fragmente abgefangen und ihre weitere Migration verhindert wird.

Diese Methode ermöglicht die Aufreinigung einer breiten Palette von DNA-Fragmentgrößen aus verschiedenen Quellen mit einer relativ hohen Effizienz von bis zu 80 %. Ihre geringen Kosten stellen einen weiteren Vorteil der Elektroelution im Vergleich zu anderen Aufreinigungsmethoden wie Säulen, Harz-Kit-Systemen und anderen dar. Die DNA-Probe wird zunächst mittels Bromid-gefärbter Agarose-Gelelektrophorese sichtbar gemacht, um das gewünschte Fragment zur Aufreinigung zu visualisieren und zu identifizieren; anschließend sollte die Elektrophorese fortgesetzt werden.

Wenn die Fragmente gut getrennt sind, können zu kleine Fragmente genau bestimmt werden. Nach der Elektrophorese wird das gewünschte Fragment sauber aus dem Gel geschnitten, wobei ein nagelneues Rasierklingenblatt verwendet wird und darauf geachtet wird, das Gelschnitz so nah wie möglich an dem Band von Interesse abzuschneiden.

Dieses Verfahren sollte unter angemessenem Schutz vor UV-Licht und mit Handschuhen durchgeführt werden. Nachdem die Elektrolutte mit dem geeigneten Brennpuffer gefüllt wurde und darauf geachtet wurde, dass dieser die Oberfläche der mittleren Platte benetzt, wird der Gelausschnitt so nah wie möglich an den V-Kanal in eines der Räder eingelegt. Es sollten keine Blasen im Vch-Kanal vorhanden sein.

Dies kann vermieden werden, indem der Kanal mit Puffer durchgespült wird, um eingeschlossene Luft zu entfernen. Anschließend werden vorsichtig 100 Mikroliter der Hochsalz-Barriere von der der Vertiefung zugewandten Stelle aus in den V-Kanal gegeben. Die Kammer wird verschlossen und die Elektroden mit der Stromquelle verbunden, um die Elektrophorese bei 100 bis 120 Volt zu beginnen.

Die Zeitdifferenz hängt von der Fragmentgröße ab, insbesondere bei großen Fragmenten bis zu 20 kb. 50 Minuten bis eine Stunde sollten ausreichen; bei kleinen Fragmenten ist eine Überwachung im Abstand von jeweils 10 Minuten mittels UV-Licht erforderlich, um eine weitere Elution durch die Salzlösung und in die endständige Pufferkette zu vermeiden. In diesem Fall haben wir 560 Nanogramm Plasmid mit den Enzymen ND1 und Entry verdaut, um ein Fragment von 900 Basenpaaren freizusetzen, was 84 Nanogramm einer Probe entspricht.

Dementsprechend erfolgt nach dem Einlegen des Gelstücks in die Mulde die Elektroelution 25 Minuten lang bei 100 Volt. Sobald die Elektroelution abgeschlossen ist und die DNA-Fragmente im südlichen Kissen innerhalb des V-Kanals festgehalten werden, werden 400 Mikroliter Lösung aus dem Kanal gewonnen, und zwar von der distalen Seite des Behälters, und mithilfe einer feinen Spitze, die an einem Mikropipettiergerät befestigt ist, in ein 1,5-Mikroliter-Mikroröhrchen überführt. Danach wird die Alkoholpräzipitation durch Zugabe von zwei Volumina kaltem absolutem Ethanol durchgeführt und mittels Vortexen vermischt. Zusätzlich können zwei bis drei Mikroliter Glykogen zugegeben werden, um die Ausbeute an DNA zu verbessern. Die klassischen Röhrchen werden eine Stunde lang bei minus 20 Grad Celsius oder alternativ über Nacht bei dieser Temperatur gelagert, anschließend bei vier Grad Celsius mit maximaler Drehzahl 25 Minuten lang zentrifugiert.

Dieses Cardio-Supernatant und Waschmittel durch Zugabe von einem Milliliter kaltem, 70 %igem Ethanol. Zentrifugieren Sie bei vier Grad Celsius mit maximaler Geschwindigkeit für fünf bis 10 Minuten, verwerfen Sie das Supernatant und lassen Sie es bei Raumtemperatur trocknen, wobei die Röhrchen invertiert positioniert sind. Lösen Sie das Pellet in 10 bis 15 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser auf und bestimmen Sie anschließend die Konzentration der Probe. In diesem Fall wurde die gereinigte Probe in 10 Mikrolitern Wasser resuspendiert und in einem Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 260 Nanometern quantifiziert, was eine Konzentration von 6,3 Nanogramm pro Mikroliter ergab und eine Reinigungseffizienz von 75 % darstellt. Sie könnten denken, es wäre besser, nur 10 Minuten Ihrer kostbaren Zeit mit einem Kit zu investieren.

Jedoch, trotz des Zeitaufwands, der bei diesem Verfahren entsteht, werden Sie viele der Variablen kontrollieren können, die es Ihnen ermöglichen, eine breitere Palette von Proben unterschiedlicher Größe und Herkunft zu reinigen. Wie Sie im vorliegenden Fall sehen konnten, wurde eine Reinigungseffizienz von 75 % beobachtet, die gleich gut oder besser ist als die der meisten DNA-Reinigungskits. Vielen Dank, dass Sie heute dabei waren.

Wir hoffen, dass Sie dieses Protokoll als nützlich für Ihre Forschungsprojekte empfunden haben.