Nachweis von Bakterien mit fluorogenen DNAzyme

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, das Vorhandensein spezifischer Bakterien wie e coli mithilfe neuartiger flu genic, DNA, Zyme-Sonden schnell nachzuweisen. Zunächst werden vollständige genische DNA-Zyme-Sonden durch Ligierung erzeugt. Anschließend werden Bakterien kultiviert, um die Anzahl der Zielmoleküle anzureichern, und ein angereichertes extrazelluläres Gemisch wird aus dem Überstand hergestellt.

Das rohe extrazelluläre Gemisch wird anschließend mit der DNA-Zyme-Sonde kombiniert; die Wechselwirkung zwischen der DNA-Zyme-Sonde und den Zielmolekülen führt zum Spalten der Sonde, woraufhin diese fluoresziert. Mithilfe eines Fluorimeters wird die Wechselwirkung zwischen der Sonde und dem Ziel als Anstieg der relativen Fluoreszenz erfasst. Die Ergebnisse werden anschließend mittels denaturierender Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Analyse verifiziert.

Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu PCR- oder antikörperbasierten Methoden liegt darin, dass das Verfahren einfacher und leichter durchzuführen ist. Obwohl diese Methode mit dem Modellbakterium E. coli entwickelt wurde, kann sie zur Detektion beliebiger anderer lebensmittelbedingter oder nosokomialer bakterieller Pathogene angewendet werden. Personen, die mit dieser Methode neu beginnen, werden in der Regel Schwierigkeiten haben, da sie möglicherweise nicht an den Umgang mit synthetischen DNA-Sonden und Bakterien gewöhnt sind. Die Durchführung des Verfahrens demonstrieren Sergio Aguire, ein wissenschaftlicher Mitarbeiter aus meinem Labor, und Monso Ali, ein Postdoktorand, für diesen Protokoll.

R-F-D-E-C eins ist der vorgestellte DNA-Zym. Er besteht aus der katalytischen Sequenz EC eins, die in Schwarz unterstrichen ist, und der Substratsequenz FS eins, die in Grün unterstrichen ist. Im Inneren des Substrats befindet sich eine RNA-Verbindung, die durch das blaue r gekennzeichnet ist und von einer mit Fluor markierten dT, angegeben durch F, und einer mit einem Quencher markierten dT, angegeben durch Q, flankiert wird. RF SS eins ist eine durcheinandergebrachte Version von RFD EEC eins, bei der die katalytische Sequenz EEC eins teilweise zu SS eins umgeordnet ist, während der Bereich FS eins unverändert bleibt. RF DEC eins und RF SS eins werden durch eine templatesvermittelte enzymatische Ligierung des Oligonukleotids FS eins mit dem Oligonukleotid EC eins beziehungsweise SS eins in Gegenwart von LT eins als Ligationsvorlage hergestellt, um rohe extrazelluläre Mischungen oder CEMs vorzubereiten, die als Ziel für R-F-D-E-C eins dienen. Beginnen Sie, indem Sie zwei Milliliter LB mit einer Pipettierpistole in sterile 14-Milliliter-Kulturröhrchen abgeben.

Als Nächstes mit einer sterilen Pipettenspitze eine einzelne Kolonie von E. coli von einer Agarplatte aufnehmen und in ein Kulturrohr mit LB-Medium geben. Die Röhrchen in einen Inkubator stellen, der auf 37 Grad Celsius eingestellt ist, und 14 Stunden lang bei 250 U/min schütteln. Um eine 1%-ige Neoinokulationskultur herzustellen, zwei Milliliter frisches LB-Medium in 14-Milliliter-Kulturröhrchen pipettieren und 20 Mikroliter der bakteriellen Kultur aus dem vorherigen Schritt hinzufügen.

Inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 Grad Celsius unter Schütteln mit 250 U/min, bis jede Bakterienlösung einen OD600 von etwa eins erreicht hat. Überführen Sie 1 Milliliter jeder Kultur in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 11.000 ×g für fünf Minuten. Übertragen Sie nach dem Zentrifugieren das klare Überstandsgemisch in ein frisches 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Lagern Sie das Überstand bei minus 20 Grad Celsius. Falls es nicht unmittelbar verwendet wird, um zu bestimmen, ob ein fluoreszierendes Signal bei der Wechselwirkung der DNA-Enzyme mit dem rohen Zellextrakt erzeugt wird, werden die Proben durch Spektral-Photometrie analysiert. Schalten Sie das Fluoreszenz-Spektrophotometer ein und richten Sie die Parameter für die Datenerfassung mit einer Anregung bei 488 Nanometern und einer Emission bei 520 Nanometern ein.

Richten Sie außerdem das Instrument so ein, dass es eine Stunde lang jede Minute Messwerte aufnimmt. Spülen Sie drei Quarzküvetten zuerst mit entionisiertem destilliertem Wasser und anschließend mit 100 % Ethanol. Trocknen Sie die Küvetten, indem Sie Stickstoffgas darüber strömen lassen.

Beschriften Sie die Küvetten als C1 für Kontrolle 1, C2 für Kontrolle 2 und T für Test. Geben Sie anschließend 24 Mikroliter destilliertes, deionisiertes Wasser in C1 und jeweils 24 Mikroliter der hergestellten groben extrazellulären E. coli-Mischung in C2 und T. Fügen Sie 25 Mikroliter von 2× RB zu jeder Küvette hinzu und stellen Sie diese in den Fluoreszenzspektrophotometer. Beginnen Sie fünf Minuten später mit der Erfassung der Fluoreszenzdaten, geben Sie 1 Mikroliter 5 Mikromolar RFS S1 zu C2 sowie jeweils 1 Mikroliter 5 Mikromolar RFD eec1 zu T und C1 hinzu, wobei sichergestellt werden muss, dass die Fluoreszenzmessungen nicht unterbrochen werden. Mischen Sie jede Lösung durch Pipettieren und lassen Sie die Reaktion für den verbleibenden Zeitraum der Datenaufnahme fortlaufen.

Speichern Sie die Daten im Excel-Dateiformat. Anschließend übertragen Sie die Daten auf einen Personalcomputer und verwenden Excel, um ein grafisches Bild zu erstellen. Dieselben Reaktionsgemische, die zur Analyse mittels Spektralanalyse verwendet wurden.

Die Photometrie kann zur Analyse mittels Gelelektrophorese verwendet werden. Nach einer Stunde der Aufnahme. Entfernen Sie die Küvetten aus dem Spektrophotometer und überführen Sie die Lösungen in neue Mikrozentrifugenröhrchen.

Löschen Sie die Reaktionen durch Zugabe von fünf Mikrolitern dreimolarer Natriumacetatlösung und 125 Mikrolitern 100 %igem Ethanol. Vortexen Sie jede Lösung und stellen Sie die Röhrchen nach der Inkubationszentrifugation eine Stunde lang in den minus 20 Grad Celsius kalten Gefrierschrank. Zentrifugieren Sie die Reaktionsgemische 20 Minuten bei 11.000 × g und 4 Grad Celsius und entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Pipettieren.

Trocknen Sie die Pellets mithilfe eines DNA-Konzentrators für 10 Minuten. Geben Sie 20 Mikroliter Gelauftragspuffer hinzu und wirbeln Sie kurz an. Zentrifugieren Sie kurz in einer Tischzentrifuge.

Als Nächstes 10 µL der Reaktionsproben pro Brunnen auf ein 10%-Dage-Gel laden, nachdem der Lauf beendet ist. Die Glasplatten entfernen und gründlich mit Leitungswasser waschen. Um eventuelle Gelreste zu entfernen, die Platten mit einem Kim-Tuch abwischen.

Scannen Sie die Gelelektrophoreseplatte mit einem Typhoon-Scanner auf Fluoreszenz. Analysieren Sie die resultierenden Bilder mithilfe einer Bildquantifizierungssoftware, um die Empfindlichkeit des Systems zu bewerten. Serial verdünnte Kulturen werden für zunehmende Zeiträume kultiviert.

Um die minimale Inkubationszeit zu bestimmen, die erforderlich ist, um ein einzelnes Bakterium nachzuweisen, bereiten Sie 10 Kulturröhrchen mit jeweils zwei Millilitern LB-Medium vor, impfen Sie jede Kultur mit 100 Mikrolitern einer Suspension mit zwei CFU pro Milliliter aus einer Glycerin-Kultur von E. coli an und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius unter Schütteln mit 250 U/min nach 4, 8, 12, 16 und 24 Stunden. Entnehmen Sie 300 Mikroliter aus jedem der beimpften Kulturröhrchen, da möglicherweise keine nachweisbaren Bakterien in den Proben vorhanden sind, die zu den Zeitpunkten 4, 8 und 12 entnommen wurden.

Lassen Sie die verbleibende Kultur 24 Stunden lang wachsen, um Kulturen mit Bakterien zu identifizieren. Messen Sie den OD 600 und präzipitieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 11.000 G für fünf Minuten. Überführen Sie den Überstand, der die CEMS enthält, in frische 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und lagern Sie ihn bis zur Verwendung am nächsten Tag bei minus 20 Grad Celsius.

Überprüfen Sie die Kulturen auf Wachstum. Nach der Inokulation enthalten möglicherweise nur eine oder zwei der 10 Kulturen E. coli, während die übrigen Röhrchen keine Zellen enthalten. Verwenden Sie die aus positiven Kulturen gewonnenen CEMS zu den festgelegten Zeitpunkten, um Spaltreaktionen mit RFD EEC one vorzubereiten, und analysieren Sie die Reaktionsgemische mittels DAGE-Gelelektrophorese, wie zuvor beschrieben. Sowohl der RFD EEC one- als auch der RF SS one-Probierer wurden durch enzymatische Ligierung der DNAzym-Abschnitte an das Substrat hergestellt.

Die Wechselwirkung zwischen CEM EEC und RFD EEC eins oder RF SS eins wurde anschließend mittels Spektrometrie untersucht. Wie hier zu sehen ist, erzeugte R-F-D-E-C eins ein hohes Maß an fluoreszierendem Signal nach Zugabe von CEM ec.

Im starken Gegensatz dazu erzeugte R FS S eins kein starkes fluoreszierendes Signal. Somit die fluoreszenzproduzierende Funktion von RFD EEC eins. Nach Kontakt mit CEM EC wird sequenziert.

Spezifisch, um zu überprüfen, ob die beobachteten Fluoreszenzanstiege auf die Spaltung der RNA-Verknüpfung zurückzuführen waren. Die Reaktionsgemische wurden durch dage-Analyse der Spaltung von RFD eec untersucht, wobei eine Spaltung durch 0,25 molar Natriumhydroxid voraussichtlich 2D-NA-Fragmente erzeugt, ein Fünf-Prim-Fragment, das den Fluorophor behält, und ein Drei-Prim-Fragment, das den Quencher behält. Wie hier zu sehen ist.

Die RFD EEC CEM EEC-Reaktionsmischung erzeugte tatsächlich das erwartete Spaltprodukt. Darüber hinaus wurde nur durch UNC die R-F-D-E-C-Eins gespalten, und das Fünf-Prime-Fragment konnte mittels Fluoreszenzbildgebung nachgewiesen werden. Um die Spezifität von RFD EEC Eins zu untersuchen, wurden Fluoreszenzassays durchgeführt, bei denen CEMS verwendet wurden, die ausschließlich aus mehreren anderen gramnegativen und grampositiven Bakterien gesammelt worden waren.

Die Probe, die CEM EC enthielt, zeigte einen Anstieg der Fluoreszenz. Das Fehlen einer Kreuzreaktivität mit CEMS von anderen Bakterien weist darauf hin, dass R-F-D-E-C eins hochselektiv für E. coli ist. Um die minimale Kulturzeit zu bestimmen, die erforderlich ist, um eine einzelne E. coli-Zelle nachzuweisen, wurde E. coli auf eine Konzentration von einer CFU pro Milliliter verdünnt, in 100 Mikrolitern mit Nährmedium kultiviert und nach 4, 8, 12, 16 und 24 Stunden analysiert. Die resultierenden CEMS wurden mit R-F-D-E-C eins gemischt, und der Spaltungsgrad wurde mittels DAGE wie hier gezeigt bewertet.

Ein Bild des Dage-Assays zeigt, dass R-F-D-E-C kein erwartetes Spaltprodukt erzeugt hat. Bei Reaktion mit CEM wiesen die nach vier und acht Stunden Wachstum gesammelten ECS darauf hin, dass eine Kultivierungszeit von 12 Stunden erforderlich ist, sobald die Methode beherrscht wird.

Die Schlüsselkomponente dieser Technik besteht darin, dass der auf DA-Enzymen basierende Test innerhalb von 60 Minuten durchgeführt werden kann, sofern er ordnungsgemäß durchgeführt wird, nach dieser Entwicklung. Das Verfahren ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Bioanalyse den Weg, allogene DNA-Enzyme zur Detektion einer breiten Palette bakterieller Pathogene zu erforschen.