Intravitalmikroskopie von Gehirn der Maus Mikrozirkulation mit einem Closed Cranial Fenster

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Mikrozirkulation im Maushirn mittels intravitale Mikroskopie zu untersuchen, wodurch die dynamischen Veränderungen hämodynamischer und entzündlicher Marker in der pialen Mikrozirkulation über längere Zeiträume hinweg verfolgt werden können. Diese Technik wurde am La Jolla Bioengineering Institute entwickelt, wo sie für zahlreiche Studientypen eingesetzt wurde. Beispielsweise zur Beobachtung hämodynamischer Veränderungen während des Verlaufs einer Plasmodium berghei-Infektion sowie zum Zeitpunkt des Auftretens einer zerebralen Malaria.

Dies wird erreicht, indem zunächst zwei Wochen vor den intravitale Mikroskopie-Studien ein chronisches Schädel-Fenster implantiert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Gesamtmorphologie des Schädel-Fensters mithilfe eines hochauflösenden Digitalbilds bei niedriger Vergrößerung aufzuzeichnen. Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, intravitale Mikroskopiebilder unter Verwendung konventioneller und fluoreszenter Beleuchtung aufzunehmen und spezifische Untersuchungsstellen für Online-Messungen des Gefäßdurchmessers und der Erythrozyten-Geschwindigkeit auszuwählen.

Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Adhärenz von Leukozyten und Thrombozyten in den Pfeilern mittels fluoreszenzmarkierter spezifischer Antikörper intravitale zu analysieren. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die in vivo mikrozirkulatorische Veränderungen in zerebralen Spiegelmodellen physiologischer, pathophysiologischer oder krankhafter Zustände durch intravitale Mikroskopie des Gehirns zeigen, um die mit diesen Zuständen assoziierten hämodynamischen Veränderungen zu erfassen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass wir das Gehirn in seiner physiologischen Umgebung beobachten, ohne es externen Agentien oder künstlichen Medien auszusetzen. Im Vergleich zu bildgebender Magnetresonanztomographie und Angiographie bietet die intravitale Mikroskopie eine höhere räumliche und zeitliche Auflösung und ermöglicht es uns, vom makroskopischen bis zum mikroskopischen Niveau zu untersuchen.

Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen zur Physiologie und Pathophysiologie der mikrovaskulären Durchblutung im Gehirn beantworten, beispielsweise hämodynamische und entzündliche Veränderungen während akuter und chronischer Erkrankungen. Zwei bis drei Wochen vor der intravitale Mikroskopie wird bei Mäusen im Alter von acht bis zehn Wochen eine Kraniotomie durchgeführt, wie zuvor beschrieben, mit der Ausnahme, dass keine Titanhalterung am Kopf des Tieres befestigt wird. Das chronische Schädel Fenster stellt eine stabile Präparation dar, die es ermöglicht, die piale Mikrozirkulation sogar Monate nach der Implantation am Tag des Experiments zu untersuchen.

Zunächst überprüfen Sie die Körpertemperatur des Tieres, bevor Sie das Tier in einen stereotaktischen Rahmen bringen und zuvor vorbereitete, fluoreszenzmarkierte Erythrozyten über die Schwanzvene der Maus infundieren. Dies ermöglicht die Verfolgung der Erythrozyten, was später gezeigt wird. Anschließend betäuben Sie die Maus leicht mit Isofluran.

4 % zur Induktion, ein bis 2 % zur Aufrechterhaltung. Danach das Tier in Bauchlage in einen stereotaktischen Halter auf einer Heizplatte bringen. Den Kopf vorsichtig mit den Ohrstiften fixieren und die Ebene mithilfe der rechten und linken Hebel justieren.

Reinigen Sie vorsichtig den Deckglaser des Schädel-Fensters mit einem mit Mineralöl angefeuchteten Wattestäbchen. Nehmen Sie anschließend mithilfe eines Stereomikroskops, das an eine Digitalkamera angeschlossen ist, mehrere Panoramafotos der unter dem Fenster liegenden Gefäße auf. Nach der Übertragung der Panoramafotos auf einen Computer wählen Sie das beste Bild aus, um es zu drucken, zu kennzeichnen und zu datieren.

Dieses Foto wird als Karte für die Messung des Gefäßdurchmessers und der roten Blutkörperchengeschwindigkeiten verwendet, was im Folgenden zur Einleitung der intravitale Mikroskopie gezeigt wird. Übertragen Sie die Maus auf eine speziell angefertigte Bühne für die intravitale Mikroskopie. Geben Sie einen Tropfen Wasser auf das Schädel-Fenster, wobei Sie die durch den Zahnacrylat gebildete Vertiefung nutzen.

Ein 20x-Wasserimmersionsobjektiv mit einer numerischen Apertur von 0,5 wird verwendet. Die Bilder werden mit zwei Kameras aufgezeichnet: einer digitalen lichtempfindlichen Hochgeschwindigkeitskamera, die an einen Computer und Monitor angeschlossen ist, sowie einer analogen lichtempfindlichen Kamera, die an ein VCR-Band, eine Zeitstempelvorrichtung und einen Farbmonitor angeschlossen ist. Vor der Auswahl der Gefäße zur Messung sollten die Gefäße überprüft werden, um die Qualität der Präparation zu beurteilen und festzustellen, ob Blut in allen Gefäßen fließt. Anschließend werden die zu messenden Gefäße ausgewählt. Diese sollten Venen und Arterien unterschiedlicher Durchmesser umfassen und verschiedene Bereiche innerhalb des durch das Fenster exponierten Gebiets abdecken.

In unserem Experiment wählen wir 12 Gefäße zur Messung aus, während Sie verschiedene Bereiche innerhalb des kranialen Fensters betrachten. Zur Auswahl der Gefäße kennzeichnen Sie die genaue Position jedes zu messenden Punkts auf dem zuvor aufgenommenen Foto der PY-Gefäßstruktur; dort wird der Gefäßdurchmesser mithilfe eines Bildverschiebungsgeräts gemessen. Sobald der Punkt ausgewählt ist, wird das Bild des Gefäßes in vertikaler Position ausgerichtet und das Bild so lange verschoben, bis die gegenüberliegenden.

Die Extrema werden ausgerichtet und die Messung dokumentiert. Zur Erythrozytenverfolgung wird jeder Punkt mindestens 30 Sekunden lang mit der Digitalkamera aufgezeichnet, und die Videobilder werden mit 150 Bildern pro Sekunde aufgezeichnet. Diese Rate wird gewählt, um ein bis sechs Bilder einer Zelle auf einem Videobild zu erhalten, um Geschwindigkeiten bis zu sechs Millimetern pro Sekunde bestimmen zu können.

Nach Abschluss der Datensammlung wird die Maus aus dem stereotaktischen Rahmen entfernt und in ihren Käfig zurückgebracht, um sich von der Anästhesie zu erholen, wobei geeignete Software verwendet wird. Die gewonnenen Videobilder werden digitalisiert, und es werden XY-Koordinatendaten für jedes Zellbild ermittelt. Die Zellpositionen werden manuell und nicht durch Bildanalyse bestimmt.

Da das Auge eines geschulten Beobachters eine gute Schätzung der Lage des Zellzentrums liefert, das im Allgemeinen der Position der maximalen Fluoreszenz entspricht, werden für die meisten Zellorientierungen Position und Geschwindigkeit für 15 Zellen in jedem Gefäß bestimmt. Ein Mittelwert wird berechnet, um die mittlere Erythrozyten-Geschwindigkeit zu erhalten, sobald die Gefäßdurchmesser- und Erythrozyten-Geschwindigkeitsmessungen vorliegen.

Die Berechnung des Blutflusses in jedem Gefäß kann mithilfe der Formel Q gleich D durch zwei zum Quadrat mal PI mal V erfolgen, wobei Q dem Blutfluss, V der Erythrozyten-Geschwindigkeit und D dem Gefäßdurchmesser entspricht, zur Beurteilung der Perfusion und Analyse der Leukozytenadhärenz in Pfeilerg Gefäßen. Die intravitale Mikroskopie wird an einem Tier durchgeführt, das mit einer Mischung aus FSE-markiertem Albumin und Antikörpern gegen den Pan-Leukozyten-Marker CD 45, markiert mit Texas Red, infundiert wurde. Das fluoreszenzmarkierte Albumin ermöglicht eine verbesserte Visualisierung des vaskulären Netzwerks, einschließlich eindringender Gefäße, und ist insbesondere bei Krankheitszuständen wie zerebraler Malaria nützlich, um nicht oder unzureichend perfundierte Gefäße zu identifizieren.

Die fluoreszenzmarkierten Anti-CD45-Antikörper ermöglichen es, das Rollen und die Adhäsion von Leukozyten an Gefäßwänden leicht zu identifizieren und zu quantifizieren. Die Quantifizierung der Leukozytenadhäsion erfolgt durch Zählen der Anzahl von Leukozyten in einem Gefäßabschnitt von 100 Mikron Länge. Das Rollen wird quantifiziert, indem die Anzahl der Leukozyten gezählt wird, die sich innerhalb von 30 Sekunden mit einer deutlich geringeren Geschwindigkeit als der Blutgeschwindigkeit im selben 100-Mikron-Abschnitt bewegen.

Hier ist ein Beispiel für die Messung der mikrovaskulären Erythrozyten-Geschwindigkeit durch Zellverfolgung mittels Hochgeschwindigkeitsfluoreszenz. Die Videobildaufnahmen von A bis F zeigen aufeinanderfolgende Bilder der Mikrozirkulation. Jedes Bild stellt die Position eines einzelnen fließenden Erythrozyten dar, der von der Hochgeschwindigkeitskamera bildfrequenzweise erfasst wurde.

Dieses Diagramm aus einem repräsentativen Experiment zeigt die zeitlichen Veränderungen der Blutflussgeschwindigkeit in der Milz. Bei mit Plasmodium, burgi, onca infizierten Mäusen und bei nicht infizierten Kontrollmäusen bleibt der Blutfluss in der Milz im Verlauf der Zeit relativ stabil, während infizierte Mäuse eine deutliche Abnahme des Blutflusses zum Zeitpunkt der Entwicklung einer zerebralen Malaria aufweisen.

Am sechsten Tag zeigen Färbungen mit anti-CD45-Antikörpern, die mit Texas Red fluoresziert sind, eine große Anzahl von Leukozyten, die an den Blutgefäßen einer mit Plasmodium berghei infizierten Maus haften. Dieses Verfahren hat eine breite Palette von Anwendungen jenseits der hier heute gezeigten Aufgabe. Jede optische Technik, die in vivo angewendet werden kann, lässt sich an dieses Modell anpassen, und Parameter wie Gewebe, Sauerstoffgehalt des Gewebes, pH-Wert, reaktive Sauerstoffspezies sowie die Interaktion von Endothelzellen mit Leukozyten können in diesem Modell untersucht werden.