Eine Methode zur 2-Photonen-Imaging der Blutfluss in den Neocortex durch ein Cranial Fenster

Die Möglichkeit, die zerebrale Gefäßversorgung abzubilden und die Dynamik des Blutflusses im intakten Gehirn lebender Nagetiere zu erfassen, ist eine leistungsstarke Technik, die zur Untersuchung zerebraler Ischämie oder der normalen Gehirnphysiologie eingesetzt werden kann. Hier zeigen wir, wie man zwei Verfahren der Lichtmikroskopie verwendet, um die Dynamik des Blutflusses im Neokortex lebender Mäuse mittels fluoreszierender Farbstoffe, die in die Schwanzvene injiziert wurden, abzubilden. Diese Technik wurde ursprünglich von David Kleinfeld in Winfred Dank entwickelt.

Herzlich willkommen, ich bin Ricardo Mota aus dem Labor von Carlos Porter Cayo am Fachbereich Neurologie der University of California Los Angeles. In einem vorherigen Video haben wir Ihnen die Methode zur Implantation eines Schädel-Fensters für chronische Bildgebungsexperimente in vivo gezeigt. Heute werden wir Ihnen das Verfahren zur Bildgebung der Durchblutungsdynamik in der Großhirnrinde durch ein Schädel-Fenster vorstellen.

Diese Vorbereitung ist sehr nützlich, da sie die Abbildung tiefer Gehirnregionen mittels Zweiphotonen-Laser-Mikroskopie ermöglicht. Beginnen wir also. Um die zerebrale Gefäßstruktur abzubilden, müssen die Tiere intravenös mit einem fluoreszierenden Farbstoff injiziert werden.

Wir verwenden Dextron-konjugierte Farbstoffe, da die Dextron-Gruppe verhindert, dass der Farbstoff die Blut-Hirn-Schranke überwindet und aus den Blutgefäßen austritt. Die Mäuse werden mit Isofluran anästhesiert, 4 % zur Induktion und 1,5 bis 2 % während der Injektion. Anschließend wird der Schwanz dreimal mit 70 %igem Alkohol desinfiziert, und 75 bis 100 Mikroliter einer 5 %igen Lösung von Rhodamin-Dextran in physiologischer Kochsalzlösung werden mittels einer 26-Gauge-Nadel in die Schwanzvene injiziert.

In der Mitte des Schwanzes können die Tiere unmittelbar nach der Injektion in die Schwanzvene bis zur Ausscheidung des Farbstoffs über den Urin bildlich dargestellt werden, der sich bei Verwendung des ERO-Domine-Farbstoffs rosa färbt. Ungefähr zwei Stunden nach der Injektion des fluoreszierenden Dexter-Farbstoffs wird die Maus mit Isofluran anästhesiert – erneut mit 4 % zur Induktion und 1 bis 1,5 % während der Bildgebung. Die Maus wird mithilfe einer Titanstange fest auf der Mikroskopbühne befestigt, die eine temperaturgeregelt beheizte Unterlage enthält, um das Tier warm zu halten.

Es wird etwas Augensalbe aufgetragen, um die Augen feucht zu halten. Das Deckglas des Schädel-Fensters wird mit 70 % Alkohol gereinigt. Das Fenster wird parallel zur Fokusebene ausgerichtet und im Sichtfeld zentriert.

Unter dem 4x-Objektiv ist es am besten, mit einer Digitalkamera ein Foto der Gefäße an der Gehirnoberfläche aufzunehmen. Dieses Bild dient als Referenzbild in nachfolgenden Bildgebungssitzungen, um den Bildbereich von Tag zu Tag wiederholt zu finden. Anschließend wird das 4x-Objektiv durch ein wasserimmersionsbasiertes 40x-Objektiv ersetzt.

Ohne den Tisch zu bewegen, wird das digitale Bild der Ansicht aufgenommen. Erneut werden die Koordinaten des Tischmanipulators auf null gesetzt. Wir verwenden Scan Image als Software zur Bildaufnahme.

Dies wurde in MATLAB von Tom Paul Rudo und Bernardo Sabatini im Labor von Carls Voto geschrieben. Anschließend schalten wir alle weiteren Geräte ein, den Laser, das Leistungsmessgerät, die Photomultiplierröhren, die Verstärker und so weiter. Der für die Abbildung geeignete Bereich des Fensters wird kurz bei niedriger Vergrößerung abgetastet, um die besten Regionen zu finden.

Nach deren Identifizierung wird der Aufnahmestapel der ausgewählten Region mit niedriger Vergrößerung angefertigt und ihre XY-Koordinaten werden annotiert, um die Dynamik des Blutflusses in kleinen Gefäßen oder Kapillaren aufzuzeichnen. Wir verwenden Linienabtastungen entlang von mindestens 40 Mikrometern des interessierenden Gefäßes. Diese einzelnen Abtastvorgänge, die eine Sekunde dauern, werden mit möglichst geringer Laserleistung durchgeführt, und die Koordinaten sowie der Scannenwinkel werden notiert.

Nach Beendigung der Bildgebungssitzung wird das Tier in eine warme Kammer verbracht, in der es sich von der Anästhesie erholen kann. Hier zeigen wir einen Stapel von hundert Bildern, die im Abstand von jeweils fünf Mikrometern mit unserem Zwei-Photonen-Mikroskop durch ein Schädel Fenster über dem somatosensorischen Kortex einer fünf Monate alten Maus aufgenommen wurden, der über die Schwanzvene mit r-Domine-Dextran injiziert worden war. Diese Bildsequenz zeigt das komplexe Netzwerk aus großen und kleinen Blutgefäßen, einschließlich der Kapillaren.

Wir haben Ihnen soeben eine Methode zur Visualisierung der Blutflussdynamik in vivo durch ein Schädel Fenster gezeigt. Dies ist eine äußerst leistungsfähige Methode zur Abbildung der zerebralen Blutflussdynamik in der kortikalen Gefäßversorgung, beispielsweise um Veränderungen des Blutflusses nach einem Schlaganfall zu untersuchen. Mehrere Aufnahmen können zu verschiedenen Zeitpunkten in BULs durch wiederholte Injektionen des fluoreszierenden Farbstoffs in die Schwanzvene durchgeführt werden.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, stets unter den saubersten und sterilsten Bedingungen zu arbeiten und eine sehr ruhige Hand zu haben. Gut, das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihrem Experiment.