Profiling von Pre-micro RNAs und microRNAs mittels quantitativer real-time PCR (qPCR) Arrays

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine schnelle und zuverlässige automatisierte Einrichtung von auf QPCR basierenden Arrays zu ermöglichen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Primer-Sets für das Array vorbereitet und die zu untersuchenden Proben-Master-Mischungen hergestellt werden. Anschließend wird entweder ein automatisiertes robotisches PCR-Setup oder ein Matrix-Elektronikpipettensystem verwendet, um die Proben-Master-Mischung und die Primer-Sets präzise in jede Vertiefung einer 384-Loch-Platte einzubringen.

Nach der Vorbereitung werden die PCR-Reaktionen in 384-Well-Platten mit dem Light Cycler Four 80 cyberbasierten PCR-Programm durchgeführt. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht in der Analyse der QPCR-Daten und der Bestimmung der relativen Expressionsniveaus für jedes getestete Primerpaar, von denen jedes eine spezifische mRNA gezielt anspricht. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die Veränderungen in der Expression großer Mengen von mRNAs zeigen.

Spezifisch entwickelte Arrays können daher ganze Prä-micro-RNA-Profile, bestimmte Signalwege oder für virale Infektionen entscheidende Moleküle mittels QPCR-basierter Profilerstellung gezielt ansprechen. Hallo, ich bin Dirk DMA vom Department für Mikrobiologie und Immunologie an der University of North Carolina in Chapel Hill. Heute zeigen wir Ihnen, wie man eine Echtzeit-QQPC rra aufbaut, und stellen Ihnen zwei Methoden vor.

Eine Methode unter Verwendung einer manuellen Pipette und eine unter Verwendung eines Roboters. Wir nutzen diese Technologie, um prä-mikroRNAs und reife mikroRNAs in menschlichen Tumoren zu messen. Die heutige Demonstration wird von Pauline Chu und Kristen bu durchgeführt.

Beginnen wir also. Um dieses Verfahren zu starten, entnehmen Sie Primer-Platten, die 186 Primer-Paare im 96-Well-Format mit einer Konzentration von 0,5 pM bei minus 20 Grad Celsius gelagert enthalten.

Nach dem Auftauen der Platten bei Raumtemperatur schwenken und kurz zentrifugieren. Außerdem zweimal den Cyber Green PCR-Mix bei Raumtemperatur auftauen. Für die Vorbereitung jeder 96-Loch-Primer-Platte werden vier Master-Mix-Röhrchen benötigt. Den Master-Mix herstellen, indem je nach Reaktion in jedem der vier 2-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen 4 Mikroliter Cyber Green-Mix, 3 Mikroliter PCR-Grad-Wasser und 10 bis 20 Nanogramm an Proben-DNA oder cDNA kombiniert werden.

Jeder Tube sollte genügend Master-Mix für etwa 100 Reaktionen enthalten, um Pipettierabfälle auszugleichen. Die Eppendorf-Röhrchen vortexen, um sie zu mischen. Beginnen Sie mit dem Aufbau des Precursor-micro-RNA-Assays unter Verwendung des Freedom-Tecan-EVO-Roboters, indem Sie den Roboter initialisieren und das EVO-Wear-Programm laden.

Spülen Sie den Roboter anschließend dreimal mit je 30 Milliliter Systemflüssigkeit, um Luftblasen aus dem System zu entfernen, die die Pipettiergenauigkeit beeinträchtigen würden. Richten Sie danach die Roboterplattform so ein, dass sie eine 384-Loch-Platte und eine 96-Loch-Primer-Platte enthält. Der Master mischt einen Trog, der 2 % Bleiche enthält, einen gefüllten Systemflüssigkeitsbehälter und einen leeren Abfallbehälter.

Starten Sie den automatisierten Roboterdurchlauf, indem Sie am Ende des Programms zweimal „Ausführen“ auswählen. Entfernen Sie die 384-Well-Platte und versiegeln Sie sie mit Light-Cycler-Vier-80-Deckelfolie. Zentrifugieren Sie anschließend die Platte.

Bringen Sie die verschlossene 384-Well-Platte kurzfristig in Position eins des Hotels an. Wiederholen Sie diesen Vorgang anschließend für Primer-Platte zwei mit neuen Master-Mixes und einer neuen 384-Well-Platte. Stellen Sie die resultierende verschlossene 384-Well-Platte in Position zwei des Hotels.

Öffnen Sie ein neues EVO-Bedienprogramm, um den Light Cycler vom Hotel aus zu beladen, und stellen Sie die Zyklenparameter ein. Wählen Sie anschließend zweimal „Ausführen“. Der Freedom Evo lädt automatisch jede Platte in den Light Cycler und führt das Cyber-Green-One-HRM-Zyklenprogramm durch.

Wenn der Vorgang abgeschlossen ist, überprüfen und analysieren Sie die Ergebnisse gemäß der schriftlichen Anleitung als Alternative zur Verwendung des Roboters. Eine Matrix-elektronische Mehrkanalpipette kann verwendet werden, um den Inhalt des Master-Mix-Röhrchens nacheinander in ein Reservoir zu übertragen.

Stellen Sie die elektronische Pipette so ein, dass sie 16 Mikroliter Master-Mix mit zwei Abgabeschritten à acht Mikroliter und anschließendem Spülschritt ansaugt. Nach dem Einstellen der Pipette 16 Mikroliter Master-Mix ansaugen und mit der Abgabe in eine 384-Rad-Platte beginnen. Die ersten acht Mikroliter in jede zweite Zeile der Spalte eins abgeben, wobei die Zeilen A bis O verwendet werden, und die nächste Spalte frei lassen.

Geben Sie die zweiten acht Mikroliter in dieselben Reihen der Spalte drei. Spülen Sie dann über einen Abfallbehälter und entsorgen Sie die Spitzen nach diesem Muster, bei dem abwechselnd Reihen und Spalten freigelassen werden. Geben Sie fünf weitere Zyklen lang quer über die Platte, um den Master-Mix zwei zu pipettieren.

Verwenden Sie dieselben Reihen wie bei Mastermix eins, beginnen Sie jedoch mit Spalte zwei. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die Mastermischungen drei und vier, wobei Sie jeweils mit Spalte eins und zwei beginnen, diesmal jedoch Rose B bis P.Her unter Zitierung der Primerplatte verwenden. Stellen Sie eine elektronische Pipette so ein, dass sie zwei Mikroliter ansaugt und zwei Mikroliter abgibt, gefolgt von einem Spülschritt.

Übertragen Sie zwei Mikroliter Primer von Spalte eins, Reihe A bis H einer 96-Loch-Primerplatte auf jede zweite Spalte in Reihe eins der 384-Loch-Platte; entsorgen Sie die Spitzen nach dem Abstoßen über einen Abfallbehälter. Wiederholen Sie dieses Muster für den nächsten Primer für die drei verbleibenden Master-Mixes der Spalten eins und zwei. Fahren Sie anschließend mit den Spalten zwei bis zwölf der 96-Loch-Primerplatte fort, wobei jeweils alle zwei Spalten in der 384-Loch-Platte pro Primer-Spalte übersprungen werden.

Als Nächstes versiegeln Sie die Platten mit einem Light-Cycler-Deckel, Aluminiumfolie und zentrifugieren. Kurz nach der Zentrifugation stellen Sie die Platten in einen Light Cycler 480 und führen die Platten mit dem CybrGreen-I-HRM-Nachweissystem durch.

Unter Verwendung der gleichen Zyklierungsbedingungen wie zuvor wird dieses Verfahren unter Einsatz der Primer-Platte zwei Eloqua in einer neuen 384-Loch-Platte mit frisch hergestellten Master-Mixen wiederholt. Vorläufer-mikro-RNA-Signaturen werden durch Profilierung mittels eines neuartigen qPCR-basierten Arrays sichtbar. Der mittlere Delta-CT-Wert, normiert auf U sechs, wurde berechnet, und die standardisierten Werte wurden in das Array eingetragen.

Kleinere Software zeigt drei unterschiedliche Cluster als Wärmekarten an. Die relative Expression jedes Vorläufer-microRNA ist dargestellt, wobei Rot eine Zunahme und Blau eine Abnahme der relativen Expression anzeigt. Die Farbintensität kennzeichnet das Ausmaß der Expressionsänderung.

Die Mehrheit der präkursorischen microRNAs zeigte, wie erwartet, geringfügige, statistisch nicht signifikante Veränderungen. Ein kleiner Teil der präkursorischen microRNAs nahm jedoch im Verlauf des Zeitreihenexperiments signifikant zu. Zusätzlich sank das relative Niveau einiger präkursorischer microRNAs drastisch.

In einigen Fällen gruppieren sie sich auch gemeinsam in der Heatmap-Analyse. Je nach Experiment können Cluster auftreten, die von einer Virusinfektion abhängen, zelltypspezifische Expression von precursor-microRNAs aufweisen oder precursor-microRNAs, die durch ein gemeinsames Molekül oder einen gemeinsamen Signalweg reguliert werden.

Die durchschnittlichen Zyklenschwellenwerte oder cts aus einer Posey-Sarkom-assoziierten Herpesvirus-negativen Probe, die in vierfacher Duplikatmessung durchgeführt wurde, sind dargestellt. Wichtig ist, dass das mit dem Kaposi-Sarkom assoziierte Herpesvirus-Latens-assoziierte nukleäre Antigen oder KSHV Lana in dieser Probe mittels des hochsensitiven QPCR-Arrays nicht nachgewiesen wurde. Sowohl die interne Kontrolle U sechs als auch let sieben a, ein stark exprimiertes menschliches präkursorisches Mikro-RNA, waren jedoch in nachweisbaren Mengen exprimiert.

Schließlich ergab die negative Kontrolle mit PCR-Reinstwasser, wie erwartet, kein A-Q-P-C-R-Produkt. Eine Schmelzkurvenanalyse für zwei verschiedene Primer unter Verwendung derselben Proben-Duplikate ist dargestellt.

Es ist ersichtlich, dass die Schmelztemperatur für die beiden Primer-Paare unterschiedlich ist, jedoch schmilzt die Probe bei jeder Wiederholung exakt bei derselben Temperatur. Anzeichen für eine schlechte oder möglicherweise kontaminierte Probe können mehrere Schmelzpeaks sein, die auf das Vorhandensein zweier verschiedener Eingangsquellen hindeuten. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man einen Echtzeit-QPCR-Versuch mithilfe eines Roboters einrichtet.

Es ist wichtig, dass Sie alle Kontrollen und so viele Housekeeping-Gene wie möglich einbeziehen. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.