Performing Benutzerdefinierte MicroRNA Microarray-Experimenten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein Mikro-RNA-Microarray-Experiment durchzuführen. Dies wird erreicht, indem zunächst gedruckte Microarray-Objektträger beschafft werden, die eine Bibliothek von Mikro-RNA-Sonden enthalten, und RNA-Proben mit geeigneter Qualität und Menge hergestellt werden. Anschließend werden die RNA und eine kontrollierte DNA-Probe mit fluoreszierenden Farbstoffen markiert.

Anschließend werden die markierten Nukleinsäuren einer Microarray-Platte für die Hybridisierung zugegeben. Schließlich wird die Microarray-Platte gewaschen, gescannt und regeneriert. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die die genomweite Expression von microRNAs durch Analyse der Platte hinsichtlich der Hybridisierungsintensitäten der einzelnen microRNA-Sonden zeigen.

Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im Bereich der Genexpression beantworten, beispielsweise wie normale physiologische Bedingungen oder pathologische Bedingungen die Expression mikroskaliger Bedürfnisse global unterschiedlich beeinflussen. Die Qualität der Mikroarray-Herstellung ist einer der kritischsten Faktoren für den Erfolg eines Mikroarray-Experiments. Nach der Isolierung von RNA mittels einer Methode, die kleine RNAs erhält, und dem erneuten Aufschlamm der RNA in einer Konzentration von mindestens zwei Milligramm pro Milliliter, markieren Sie die RNA in einem Reaktionsvolumen von 20 Mikrolitern, indem Sie zunächst etwa 25 Mikrogramm Gesamt-RNA mit 0,5 Mikrogramm 5'-P-C-U-D-Y-547-3' in 1× HEPES-Puffer, ergänzt mit T4-RNA-Ligase 1D TT und ATP, vermischen. Falls weniger RNA verfügbar ist, reduzieren Sie die Menge an RNA und die Reaktionsansätze entsprechend.

Wenn die RNA sehr verdünnt ist, fügen Sie einen Träger wie Hefe oder tRNA zur Unterstützung der Präzipitation hinzu und inkubieren Sie die Reaktion zwei bis 24 Stunden lang auf Eis im Kühlschrank. Geben Sie anschließend Natriumacetat auf eine Endkonzentration von 0,3 Molar und danach drei Volumina Ethanol hinzu, um die RNA über Nacht bei minus 20 Grad Celsius auszufällen. Um die Objektträger zum ersten Mal zu verwenden, hybridisieren Sie sie vorab 30 bis 60 Minuten bei 37 Grad Celsius in einer filtrierten Lösung aus 3 × SSC, 0,1 % SDS und 0,2 % BSA vor.

Als Nächstes tauchen Sie die Objektträger mehrmals in Wasser ein. Danach trocknen Sie die Objektträger in Isopropanol unter Verwendung einer Zentrifuge mit Objektträgeradapter bei 100 × g für fünf Minuten bei 22 °C. Spülen Sie die Lifter-Streifen mit Wasser ab.

Danach in Ethanol, bevor die Probe an der Luft getrocknet wird, ein Objektträger in die Basis einer Microarray-Hybridisierungskammer geben und einen Lifter-Slip auf den Objektträger legen, sodass der Lifter-Slip den Probengebiet und dessen weiße Streifen bedeckt. Die Probe im Dunkeln inkubieren, die präzipitierte markierte RNA abzentrifugieren, einmal mit 70 %igem Ethanol waschen und das Pellet an der Luft trocknen. Das Pellet sollte rötlich gefärbt sein.

Bereiten Sie eine Hybridisierungslösung vor, indem Sie ein Fünfzehntel bis ein Hundertstel des Volumens der gereinigten markierten Referenz-DNA pro RNA-Probe verwenden. Lösen Sie den RNA-Pellet vollständig in etwa 60 Mikroliter der Hybridisierungslösung auf, um sicherzustellen, dass die Hybridisierungslösung nicht austrocknet. Geben Sie während der Inkubation je 20 Mikroliter Wasser in jede der befeuchtenden Vertiefungen in der Basis der Mikroarray-Hybridisierungskammer.

Fügen Sie die Mischung aus markierter RNA und Referenz-DNA auf den Objektträger hinzu. Berühren Sie mit einer dünnen Pipettenspitze vorsichtig die Kante des Lifter-Slips und saugen Sie die Lösung an. Lassen Sie die Lösung in den Raum zwischen dem Lifter-Slip und dem Objektträger eindringen.

Platzieren Sie die Abdeckung der Hybridisierungskammer auf der Basis. Verschließen Sie die Kammer anschließend mit Metallclips. Stellen Sie die gesamte Kammer in die mitgelieferte Plastiktüte, die zum Kammerkassetten-Set gehört.

Schließlich wird die Kammerkassette in einen Behälter mit einem feuchten Papiertuch gegeben. Anschließend wird der Behälter mit Frischhaltefolie abgedeckt und für etwa 24 Stunden in einen befeuchteten Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius gestellt. Um die Objektträger nach der Hybridisierung zu bearbeiten, werden die Kammerkassetten einzeln auseinandergebaut, ein Objektträger und sein Hebeschieber einzeln in zwei XSSC bei 22 Grad Celsius getaucht.

Der Lifter-Slip löst sich von der Folie, waschen Sie die Objektträger zweimal in 0,8 XSSC und dann dreimal in 0,4 XSSC insgesamt ein bis zwei Minuten lang. Trocknen Sie die Objektträger mit einem Zentrifugenadapter für Objektträger. Danach scannen Sie die Objektträger mit einem Microarray-Scanner und verwenden ein Programm wie Blue Fuse, um die Intensitäten in den Bilddateien zu quantifizieren.

Untersuchen Sie einzelne Flecken, um abnormale Flecken auszuschließen, die üblicherweise durch das Bedrucken oder die Handhabung der Porenplatte nach der Hybridisierung entstehen. Verwenden Sie für die Datenanalyse und -darstellung Programme wie Gene Spring und Excel, um das Microarray erneut zu verwenden. Entfernen Sie die Markierung, indem Sie den Objektträger mit Wasser spülen und anschließend in eine Färbeschale mit vorgewärmter 1-Millimolar-NAOH-Lösung und 0,1 XSSC bei 62 Grad Celsius für 10 bis 20 Minuten eintauchen.

Die Inkubation ein zweites Mal wiederholen. Die Objektträger mehrmals bis zu 60 Minuten lang bei 22 Grad Celsius mit Wasser unter sanftem Schütteln waschen. Die Objektträger mittels einer Zentrifuge trocknen und bei 22 Grad Celsius lagern.

Die Objektträger können ohne Vorhybridisierung verwendet werden. Diese Abbildung zeigt ein gescanntes Bild eines Microarrays, das sehr präzise und starke Hybridisierungssignale demonstriert. Rote Flecken entstanden durch die Hybridisierung der Referenz-DNA, grüne Flecken durch die mit DY 547 markierte RNA-Probe, und die gelben Flecken resultierten aus der Hybridisierung sowohl der DNA als auch der RNA an dieselben Sonden.

Die Pearson-Korrelationskoeffizienten zwischen technischen Wiederholungen der Microarray-Hybridisierung liegen bei etwa 0,99 und weisen auf eine hervorragende Reproduzierbarkeit hin. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein benutzerdefiniertes Microarray-Experiment durchführt, nicht nur zur Quantifizierung von Micronase, sondern auch zur Quantifizierung anderer Arten von Nukleinsäuren wie mRNA.