Visualisierung der UV-induzierten Replikation Zwischenprodukte in E. coli Mit Hilfe von zweidimensionalen Agarose-Gel-Analyse

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die DNA-strukturellen Zwischenprodukte sichtbar zu machen, die entstehen, wenn die Replikation auf DNA-Läsionen trifft, unter Verwendung einer zweidimensionalen Gelelektrophorese. Dies wird erreicht, indem zunächst die DNA aus aktiv teilenden Zellen isoliert wird, in denen replikationsblockierende Läsionen induziert wurden. Anschließend wird die Gelelektrophorese verwendet, um die gewonnene DNA anhand ihrer Größe zu trennen.

Anschließend werden die Gelen ausschneiden und horizontal in ein zweites Gel eingebracht, das die DNA weiter basierend auf Größe und Form trennt. Schließlich wird eine Southern-Analyse verwendet, um die DNA-Strukturen sichtbar zu machen, die mit replizierenden DNA-Fragmenten zu Zeitpunkten vor und zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Einbringung von UV-induzierten Schäden assoziiert sind. Letztendlich kann dieses Verfahren zeigen, dass die Unfähigkeit, DNA-Läsionen in bestimmten Mutanten zu verarbeiten, zur Anreicherung von DNA-Reparatur-Intermediaten führt.

Hallo, mein Name ist Arthur Ian. Ich komme aus dem Corella-Labor der Portland State University. Hallo, mein Name ist Brand she, ich komme ebenfalls aus dem Corella-Labor.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur zweidimensionalen Gelelektrophorese. In unserem Labor nutzen wir dieses Verfahren, um Intermediatmoleküle der DNA-Replikation und -Reparatur zu untersuchen. Beginnen wir also.

Um dieses Verfahren zu beginnen, züchten Sie eine 200 µL große Übernachtkultur von E. coli, die das Plasmid PBR 3 22 in DGC-Thigh-Medium mit Ampicillin bei 37 °C enthält. Die Verwendung von DGC-Thigh-Medium minimiert die UV-Abschirmung. Nach der Übernachtinkubation pelletieren Sie die Zellen bei 14.000 ×g für 30 Sekunden.

Suspenderen Sie das Zellpellet anschließend in 200 Mikrolitern DG-C-th-Medium ohne Ampicillin und impfen Sie es an. Kultivieren Sie 20 Milliliter DG-C-th-Medium ohne Ampicillin-Selektion. Führen Sie das Wachstum in einem schüttelnden Inkubator bei 37 Grad Celsius bis zu einem OD600 von 0,5 durch, was einer Dichte von etwa fünf mal 10 hoch acht Zellen pro Milliliter entspricht. Das Wachstum ohne Ampicillin vermeidet eine Selektion gegen abnormale oder unproduktive Replikationsintermediate, die bei einigen Mutanten auftreten können.

Zusätzlich ist, falls UV-Licht zur Schädigungsinduktion verwendet wird, die Entfernung des Ampicillins aus dem Medium notwendig, da es bei diesen Wellenlängen stark absorbiert und die Zellen abschirmt, wodurch die effektive Dosis an UV-Strahlung während des Wachstums der Zellen verringert wird. Verwenden Sie ein UVC-Photometer, um den Abstand zu einer 15-Watt-keimabtötenden Lampe zu bestimmen, der eine Bestrahlungsstärke von etwa einem JUUL pro Quadratmeter pro Sekunde erzeugt.

Die nachfolgenden Schritte sollten unter gelbem Licht durchgeführt werden, da dies die photoreaktive Umkehrung von Cyclobutan-Pyrimidin-Dimeren durch Photolyase nach UV-Bestrahlung verhindert. Sobald die gewünschte Zelldichte erreicht ist, überführen Sie die Kultur mit einer Pipette in eine Petrischale mit 15 cm Durchmesser auf einer rotierenden Plattform, um eine gleichmäßige Bestrahlung der gesamten Zellpopulation sicherzustellen. Bestrahlen Sie anschließend die Kulturen mit 50 Joule pro Quadratmeter und übertragen Sie sie unverzüglich in einen sterilen, vorgewärmten Kolben. Stellen Sie den Kolben danach zurück in den schüttelnden Inkubator bei 37 Grad Celsius.

Für die Dauer des Experiments erzeugt diese Dosis durchschnittlich ein Cyclobutan-Pyrimidin-Dimer pro 4,5 Kilobasen Einzelstrang-DNA für jeden zu untersuchenden Zeitpunkt. Pipettieren Sie ein 0,75-Milliliter-Aliquot der Kultur in 0,75 Milliliter eiskaltes NET 30-Puffer. NET 30-Puffer dient als Stopp-Puffer, der Replikation und Nukleotid-Exzisionsreparatur daran hindert, fortzuschreiten.

Nach Zugabe des Stopfpuffers kann die Probe bis zum Ende der Zeitreihe auf Eis aufbewahrt werden. Nach der Zeitreihe jede Probe pelletieren und die Pellets resuspendieren. Die Zellen in 150 Mikroliter Lysepuffer bei 37 Grad Celsius 20 Minuten lang ohne Rühren lysieren.

Da sich replizierende Strukturen mit Einzelstrangbereichen oder Verzweigungspunkten leichter zerschneiden lassen, schneiden Sie die Pipettenspitzen mit einer Rasierklinge ab, um die Mündung zu verbreitern und Scherkräfte zu minimieren. Im Allgemeinen sollten das Pipettieren und Rühren bis nach der Verdauung der DNA mit Restriktionsenzymen nach der Lyse auf ein Minimum beschränkt werden. Geben Sie nach der Lyse Proteinase K und Sarcosyl hinzu und lassen Sie die Inkubation eine Stunde lang weiterlaufen. Dies dient der Freisetzung von DNA-Fragmenten, die mit Proteinen assoziiert sind.

Da aktive replizierende DNA häufig an Protein- oder Membrankomplexe gebunden ist, erhöht dies die Ausbeute an Replikationsfragmenten. Nach einer Stunde die Proben extrahieren, indem zwei Volumina Phenol zu jeder Probe gegeben und die Röhrchen fünf Minuten lang vorsichtig invertiert werden. Anschließend zwei Volumina Chloroform, Isoamylalkohol hinzufügen und die Röhrchen weitere fünf Minuten vorsichtig invertieren.

Zentrifugieren Sie anschließend die Proben fünf Minuten lang mit 14.000 U/min in einer Mikrozentrifuge und überführen Sie die obere wässrige Phase jeder Probe in ein frisches Röhrchen. Geben Sie dann das Vierfache des Volumens an Chloroform-ISO-Alkohol hinzu und invertieren Sie die Röhrchen erneut vorsichtig für fünf Minuten. Zentrifugieren Sie die Proben erneut fünf Minuten lang mit 14.000 U/min.

Legen Sie eine Dialysemembran auf 250 Milliliter 0,1 xte in einem Becher und geben Sie 100 Mikroliter jeder Probe auf die Membran. Lassen Sie die Proben nach der Dialyse eine Stunde lang dialysieren. Geben Sie 80 Mikroliter jeder Probe in ein frisches 1,5-Milliliter-Röhrchen, das 20 Mikroliter Enzymgemisch enthält.

Digrieren Sie die Proben über Nacht bei 37 Grad Celsius. PV zwei linearisiert das Plasmid direkt stromabwärts vom Replikationsursprung. Geben Sie vor dem Beladen des Agarosegels 100 Mikroliter Chloroform und 20 Mikroliter sechsfarbigen Farbstoff, der Bromo enthält, hinzu.

Phenolblau und Xylencyan zu jeder Probe geben und Chloroform hinzufügen, um eventuell an DNA-Enden gebundenes PV vollständig zu entfernen. Beginnen Sie die zweidimensionale Agarose-Gelelektrophorese, indem Sie die geschnittenen DNA-Proben in der ersten Dimension laufen lassen. Laden Sie zunächst einen Lambda-HindIII-Größenmarker in die erste Spur eines zuvor vorbereiteten 0,4 %igen Agarosegels in 1×TBE.

Dann laden Sie 40 Mikroliter der wässrigen Phase, die den Lade-Farbstoff für jede Probe enthält, auf, wobei Läufe übersprungen werden, um das Schneiden des Gels zu erleichtern. Nach der Elektrophorese führen Sie die erste Dimension bei einer Spannung von einem Volt pro Zentimeter für etwa 12 bis 15 Stunden durch. Die niedrige Spannung und das Agarosegel mit niedrigem Prozentanteil dienen hauptsächlich der Trennung der DNA-Fragmente nach Größe.

Nachdem die erste Dimension durchgelaufen ist, schneiden Sie mit einem großen Metzgermesser die erste Spur, die den Lambda-Hind-III-Marker enthält, aus und färben Sie mit Äthidiumbromid. Für die zweite Dimension schneiden Sie die Gele mit dem großen Metzgermesser entlang der Spuren unter Verwendung des Lambda-Hind-III-Markers als Orientierungshilfe aus und entsorgen Sie den Bereich unterhalb der Position, an der das linearisierte Plasmid in jeder Spur erwartet wird. Zum Gießen der zweiten Dimension legen Sie jeden Schnitt horizontal über die Oberseite eines leeren Giegels.

Bereiten Sie eine Lösung mit 1 % AROS in einem XTBE vor und kühlen Sie sie auf 55 Grad Celsius ab. Gießen Sie nach dem Abkühlen die Gel-Lösung, um die zweite Dimension zu gießen, und achten Sie darauf, dass die Gel-Scheiben vollständig bedeckt sind. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Scheiben gleichmäßig ausgerichtet sind und der Gießrahmen waagerecht steht, bevor das Gel gegossen wird.

Nachdem das Gel erstarrt ist, führen Sie die zweite Dimension fünf einhalb bis sieben Stunden lang bei 6,5 Volt pro Zentimeter in einer Elektrophoreseeinheit durch, die eine effektive Umwälzung des Puffers bei Hochspannung und hohem Agarosegehalt ermöglicht. Dabei werden die DNA-Fragmente aufgrund ihrer Form sowie ihrer Größe getrennt. Nichtlineare Formen wandern nach der Elektrophorese langsamer durch die zweite Dimension. Spülen Sie das Gel einmal mit Wasser ab und waschen Sie es anschließend zweimal je 15 Minuten mit 400 Milliliter 0,25-molarer Salzsäure unter leichtem Schütteln.

Die Säurewäschen dienen dazu, die DNA-Moleküle teilweise in kleinere Fragmente einzuschneiden, die während der Southern-Analyse effizienter übertragen werden und aufgrund der großen Größe und ungewöhnlichen Form der DNA-Replikationsintermediate notwendig sind. Um das Gel für die alkalische Übertragung vorzubereiten, spülen Sie das Gel erneut mit Wasser ab und waschen es anschließend zweimal in 400 Milliliter 0,4-molarer Natriumhydroxidlösung je 30 Minuten lang. Die DNA in den Gelen wird dann mittels eines gravitationsgestützten alkalischen Transfersystems auf eine High-Bond-N+-Nylonmembran übertragen, wobei 0,4 molare Natriumhydroxidlösung verwendet wird, wie im schriftlichen Teil dieses Verfahrens beschrieben. Lassen Sie die DNA sechs bis zwölf Stunden übertragen. Anschließend fahren Sie gemäß dem schriftlichen Protokoll mit der Sondenhybridisierung fort.

Nachdem die Membran inkubiert und gewaschen wurde, legen Sie die Membran auf ein Papierhandtuch, bis die Flüssigkeit sichtbar verschwunden ist. Wickeln Sie die Membran dann in Polyvinylchlorid-Folie ein und belichten Sie sie auf einem Phospho-Imager-Screen. Schließlich kann die Radioaktivität mit einem Storm-840-Gerät und der dazugehörigen Image-Quant-Software sichtbar gemacht und quantifiziert werden.

Das Migrationsmuster von PV zwei verdautem PBR 3 22-Plasmid, beobachtet mittels 2D-Aros-Gel-Analyse, ist dargestellt. Nicht replizierende lineare Plasmide wandern als lineares 4,4-KB-Fragment, während replizierende Plasmide Y-förmige Strukturen bilden, die aufgrund ihrer größeren Größe und ihrer nichtlinearen Form langsamer wandern als die nicht replizierenden Fragmente. Dieses Migrationsmuster bildet einen Bogen, der sich vom linearen Bereich in Richtung der Mulde nach UV-Bestrahlung erstreckt.

Doppelte Y- oder X-förmige Moleküle werden im Kegelbereich beobachtet und wandern langsamer als der Bogen aus Y-förmigen Molekülen. Ein Beispiel der Southern-Analyse des mit P 32 markierten PBR 3 22 hybridisierten 2D-Gels ist für Zellen unmittelbar nach UV-Bestrahlung und 15 Minuten nach UV-Bestrahlung dargestellt. Etwa 1 % der gesamten zellulären DNA findet sich im Y-Bogen, wenn sich die Zellen nach einer Bestrahlung in der exponentiellen Wachstumsphase schnell teilen.

Ein vorübergehender Anstieg von Y-förmigen Molekülen wird beobachtet, wenn blockierte Replikationsgabeln an beschädigten Stellen anreichern. Die L-förmigen Replikationsintermediate reichern sich ebenfalls vorübergehend an und verbleiben bis zu einem Zeitpunkt, der mit der Reparatur der Läsionen korreliert. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man DNA-Reparaturintermediate mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese sichtbar machen kann.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, auf Scherkräfte zu achten, die die Ausbeute verringern können, und alle Proben sowie Gele schonend zu behandeln. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.