Large Scale Zebrafisch-Based In-vivo- Small Molecule-Screen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, kleine Moleküle zu finden, die spezifisch wichtige Aspekte der embryonalen Entwicklung und Physiologie modulieren. Dies wird erreicht, indem eine große Anzahl befruchteter Eier in 96-Well-Screening-Platten überführt wird, was als zweiter Schritt erfolgt. Anschließend werden Aliquote einer Bibliothek kleiner Moleküle den Embryonen in den 96-Well-Platten zugegeben.

Multiwellplatten werden auf Phänotypen untersucht, die durch die kleinen Moleküle hervorgerufen werden. Es werden Ergebnisse erhalten, die zeigen, welche kleinen Moleküle die Entwicklung oder Physiologie von Superfischen gezielt beeinflussen. Hallo, mein Name ist Charles Hong an der medizinischen Fakultät der Vanderbilt University.

In unserem Labor führen wir Hochdurchsatz-Chemikalien-Screens mit Zebrafischembryonen durch. Dies ist eine relativ einfache Technik, die breit angepasst werden kann, um neuartige bioaktive Verbindungen zu entdecken. Am Nachmittag vor dem Tag des Chemikalien-Screens richten Sie 10 bis 20 Zebrafisch-Zuchtbecken ein.

Platzieren Sie einen Trenner in jeden Behälter und füllen Sie jeden Behälter mit Wasser aus dem Aquakultursystem, wobei ein ausgewachsener männlicher und ein bis zwei ausgewachsene weibliche Zebrafische mithilfe eines Fischnetzes in den inneren Behälter überführt werden. Beschriften Sie in jedem Zuchtbehälter die Behälter und legen Sie am Morgen des Screenings einen Deckel darauf. Entfernen Sie die Trenner aus den Zuchtbehältern und lassen Sie die Zebrafische paaren.

Während der nächsten Stunde. Lassen Sie befruchtete Eier durch das Gitter am Boden jedes inneren Behälters fallen. Nach einer Stunde bringen Sie die adulten Seberfische zurück in die dauerhaften Aufbewahrungstanks.

Entfernen Sie den inneren Behälter und sammeln Sie die Eier, indem Sie das Wasser aus jedem Zuchtbehälter durch ein Plastikteesieb abgießen. Stellen Sie das Sieb auf eine Petrischale umgedreht auf und spülen Sie es vorsichtig ab, um die Eier in die Petrischale zu spülen. Mit einer Spüllasche, die E3-Medium enthält, sollten alle unbefruchteten Eier, die trüb erscheinen, entfernt werden.

Unter Verwendung einer Einweg-Plastikpipette sollte jeder Kreuzungsansatz etwa 200 Embryonen liefern. Anschließend etwa fünf Embryonen in E3-Medium mithilfe einer Glas-Pasteur-Pipette in jedes Loch einer 96-Loch-Platte übertragen. Sobald die Embryonen auf einer 96-Loch-Platte angeordnet sind.

Entfernen Sie mithilfe einer 12-Kanal-Pipette so viel wie möglich vom E-drei-Medium aus den Vertiefungen, wobei darauf geachtet werden muss, die Embryonen nicht zu verletzen. Geben Sie anschließend mit der 12-Kanal-Pipette 250 Mikroliter E drei zu.

Medium, das 0,5 Mikrogramm pro Milliliter Canamycin enthält, so schnell wie möglich in jede Vertiefung geben, um zu verhindern, dass die Embryonen austrocknen. Die 96-Loch-Platten in einen Inkubator bei 28,5 °C stellen, bis die Embryonen den gewünschten Entwicklungsstadium erreichen, zu dem die Verbindungen zugegeben werden sollen. In diesem Protokoll suchen wir nach Verbindungen, die die frühe embryonale Musterbildung stören, und werden die Embryonen für drei Stunden oder bis bei mehr als 90 % der Embryonen das Stadium der 1000 Zellen erreicht ist, inkubieren, da kleine Molekül-Bibliotheken in der Regel so bereitgestellt werden.

In einer 96-Well-Quellplatte, in der jede Verbindung als 10 Millimolar-Stammlösung in DMSO gelagert ist, eine geeignete Anzahl von 96-Well-Platten mit Aliquots kleiner Moleküle etwa 60 Minuten vor Erreichen des gewünschten Entwicklungsstadiums durch die Embryonen auftauen. Notieren Sie die Serien- oder andere Identifikationsnummer der Quellplatten, um Kondensation an den Platten zu minimieren. T fall in eine Trockenkammer mit Trockenmittel.Rechts.

Die Platten kurz in einer Tischzentrifuge mit einem Adapter für Mehrwellplatten abspinnen. Die Aluminiumdeckfolie von der Quellplatte mit einer 12-Kanal-Pipette entfernen und die Verbindungen in der Quellplatte mit DMSO auf die gewünschte Konzentration verdünnen. In diesem Protokoll verwenden wir eine Endkonzentration von 0,5 Millimolar und geben 4,75 Mikroliter DMSO hinzu, um die 10-Millimolar-Stammlösung zu verdünnen.

Wenn die Embryonen in der 96-Well-Platte das gewünschte Entwicklungsstadium erreicht haben, überführen Sie mit einer 12-Kanal-Pipette 2,5 µL der Verbindungen von den Quellplatten in die Zielplatten, die die Embryonen enthalten. Decken Sie die Platten, die nun die Embryonen und Verbindungen enthalten, mit Deckeln ab und notieren Sie die Identifikationsnummer der Quellplatten auf den Embryonalplatten. Mischen Sie die Platten durch vorsichtiges Schwenken und stellen Sie sie in einen Inkubator bei 28,5 °C.

Decken Sie jede Quellplatte mit ungenutzten kleinen Molekülen mit Aluminiumfolie ab, verschließen Sie sie mit Klebeband und lagern Sie sie zur Langzeitkonservierung bei minus 80 Grad Celsius ein. Formulieren Sie vor Durchführung des visuellen Screens ein spezifisches Kriterium für einen Treffer. Beispielsweise könnte bei einem Screen nach kleinen Molekülen, die die Entwicklung von vier Gehirnbereichen hemmen, ein Treffer eine Verbindung sein, die zum Verlust des Vorderhirns führt.

Das Fehlen von Augen ist ein einfacher visueller Indikator für den Verlust des Vorderhirns und erfordert keine Fluoreszenzuntersuchung zu den gewünschten Zeitpunkten der Entwicklung. Entfernen Sie die 96-Loch-Platten mit den mit der Substanz behandelten Embryonen aus dem Inkubator und untersuchen Sie jedes Loch unter einem Stereomikroskop, wenn Sie nach kleinen Molekülinhibitoren der Vorderhirnentwicklung screenen. Untersuchen Sie die Platten nach 28 Stunden auf den Verlust des Auges als Marker für die Hemmung der Vorderhirnentwicklung. Notieren Sie die Identität der Platte und die Position des Lochs für jedes Loch, in dem mindestens drei von fünf Embryonen das vorgeschriebene hi-Phänotyp aufweisen. Stellen Sie die 96-Loch-Platte zurück in den Inkubator.

Bestätigen Sie erneut den Verlust der Augen und des Vorderhirns nach 48 Stunden. Obwohl die Embryonen kein Vorderhirn besitzen werden, überleben sie mindestens bis zu vier Tage. Bestätigen Sie einen möglichen Treffer erneut, indem Sie die Wirkung der Substanz in mehreren Dosen erneut testen; für jede Dosis werden 10 Embryonen in 0,5 Milliliter E3-Medium in einem 48-Well-Plattenformat getestet.

Der Zeitpunkt der Zugabe der Verbindung zur erneuten Prüfung sollte identisch mit dem des ursprünglichen Screenings sein. Ein HIIT wird bestätigt, wenn das hervorgerufene Phänotyp bei der erneuten Prüfung der Verbindung dosisabhängig reproduziert wird. Schließlich wird die hi-Verbindung aus der Datenbank kleiner Moleküle in der chemischen Bibliothek identifiziert.

Mithilfe eines auf Zebrafischen basierenden visuellen chemischen Screenings entdeckten wir ein kleines Molekül, das den Hedgehog-Signalweg aufgrund seiner Wirkung auf die Körperachse hemmt. Dieses Bild zeigt Embryonen, die dem Hedgehog-Inhibitor ausgesetzt waren und eine deutliche ventrale Krümmung des Schwanzes aufweisen. Bei 24 Stunden zeigten dieselben Embryonen, die bei 48 Stunden untersucht wurden, weiterhin das ventral gekrümmte Phänotyp.

Diese Aufnahme zeigt das mit der Verbindung behandelte Embryo im Vergleich zum Embryo mit einer Hedgehog-Signalweg-Mutation. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann eine Person etwa 400 Verbindungen pro Woche innerhalb weniger Stunden screenen. Diese Technik hat zudem den Weg dafür geebnet, dass chemische Biologen Prozesse wie die Zellentwicklung, Zellsignalwege und die embryonale Entwicklung untersuchen können.

Bei der Arbeit mit nicht charakterisierten kleinen Molekülen ist es wichtig, angemessene Sicherheitsmaßnahmen zu beachten, wie das Tragen von Laborkitteln und Handschuhen, da diese nicht charakterisierten Moleküle potenziell gefährlich sein könnten.