Entwicklung von automatisierten Imaging und Analyse für Zebrafisch chemische Bildschirme.

In diesem Video wird eine bildbasierte Hochdurchsatz-Screening-Methode durchgeführt, um die Modulation des Fibroblastenwachstumsfaktor-Ras-MAP-Kinase-Signalwegs durch kleine Moleküle in Zebrafischembryonen zu untersuchen. Transgene männliche und Wildtyp-weibliche Zebrafische werden in einem Zuchtkäfig verpaart. Die befruchteten Eier fallen nach unten und werden gesammelt sowie in eine Petrischale überführt. Die Embryonen werden über Nacht inkubiert und anschließend in die einzelnen Vertiefungen einer 96-Loch-Rundbodenplatte gegeben.

Das kleine Molekül BCI wird hinzugefügt, um die FGF-Signalübertragung zu verstärken, und die Platte wird sechs Stunden lang inkubiert. Bilder aus jedem Well werden mit einem konfokalen Plattenreader aufgenommen und mithilfe eines selbstentwickelten Algorithmus analysiert, der die Fluoreszenzintensitäten in bestimmten embryonalen Strukturen angibt. Hallo, ich bin Hiba Kado aus dem Labor von Dr. Michael Chang an der Abteilung für Mikrobiologie und molekulare Genetik an der University of Pittsburgh.

Hallo, ich bin Andrea Spock vom Drug Discovery Institute der University of Pittsburgh. Heute zeigen wir Ihnen das Verfahren zur Zucht, Auswahl und Anordnung von Zebrafischembryonen für chemische Behandlungen. In einer 96-Loch-Platte verwenden wir transgene Embryonen, die über Fibroblastenwachstumsfaktor-Aktivitäten berichten, und behandeln sie mit einem Molekül, das diesen Signalweg überaktiviert.

Wir zeigen Ihnen, wie wir mithilfe der Hochdurchsatz-Screening-Methode die Aktivität des Fibroblastenwachstumsfaktors in transgenen Zebrafischembryonen automatisch erfassen, analysieren und quantifizieren. Dieses Verfahren verdeutlicht die Plattformtechnologie zur Nutzung transgener Zebrafische und chemischer Hochdurchsatz-Screens. Beginnen wir also.

Zwei Tage vor der Behandlung homozygote männliche transgene Zebrafische identifizieren und in einzelne Paarungstanks platzieren. Trennwände in die Tanks einsetzen, dann jeweils einen Wildtyp-Weibchenfisch hinzufügen und die Fische über Nacht bei 28 Grad Celsius in den Paarkäfigen belassen. Am nächsten Morgen die Trennwand entfernen. Nach einer Stunde die Fische in einen neuen Tank verbringen und die Embryonen in ein Plastiksieb gießen.

Überführen Sie die Embryonen in 100-Millimeter-Schalen mit E3-Lösung und inkubieren Sie sie bei 28 Grad Celsius für sechs bis acht Stunden. Nach der Inkubation untersuchen Sie die Embryonen unter einem Stereomikroskop. Für Experimente geeignete Embryonen befinden sich in der Gasphase.

Zu diesem Zeitpunkt sollten alle unbefruchteten Embryonen entfernt werden, die im Einzelzellstadium verbleiben. Entfernen Sie außerdem nicht lebensfähige Embryonen, die trüb oder fehlerhaft geformt erscheinen. Anschließend frische E3-Lösung hinzufügen und über Nacht bei 28 Grad Celsius inkubieren.

Am nächsten Tag die Embryonen unter ein fluoreszierendes Stereomikroskop stellen, um transgene Embryonen nach ähnlichem Entwicklungsstadium und gleichmäßiger GFP-Expression zu sortieren. Bei 24 HPF zeigen die Embryonen eine sichtbare Grenze zwischen Mittel- und Hinterhirn mit intensiver GFP-Expression sowie gut ausgebildete Augen mit GFP-positiven dorsalen Netzhäuten. Diese Embryonen sind aktiv und bewegen sich innerhalb ihres Keimblases, wobei sie mit einer plastischen Pasteurpipette zappeln und wackeln.

Überführen Sie die 24 HPF-Embryonen einzeln in einzelne Vertiefungen einer 96-Loch-Platte. Entfernen Sie mithilfe einer Mikropipette jegliche überschüssige E-drei-Lösung aus den Vertiefungen. Fügen Sie anschließend mit einem Mehrkanalpipettierer 200 Mikroliter E-drei-Lösung zu jeder Vertiefung hinzu.

Fügen Sie anschließend zwei Mikroliter DMSO in alle Vertiefungen der Spalten eins und 12 hinzu. Geben Sie dann zwei Mikroliter BCL, das in DMSO vorbereitet wurde, wie folgt hinzu: ein Mikromolar in die Spalten zwei und sieben, fünf Mikromolar in die Spalten drei und acht, 10 Mikromolar in die Spalten vier und neun, 20 Mikromolar in die Spalten fünf und zehn.

Mikromolar in die Spalten fünf und 10. Und schließlich 25 Mikromolar in die Spalte sechs und 11. Decken Sie die Platte nun mit Aluminiumfolie ab und inkubieren Sie sie sechs Stunden bei 28 Grad Celsius.

Fügen Sie 10 Mikroliter Trica pro Vertiefung hinzu, um die 30 HPF-Embryonen zu anästhesieren. Danach laden Sie die Platte in die Molecular Devices ImageXpress Ultra Open MetaXpress-Software. Wählen Sie eine Konfiguration mit einem Forex-Objektiv und maximalem Pinhole-Durchmesser.

Konfigurieren Sie den automatischen Laser-Fokus so, dass er den Plattenboden erkennt, und verwenden Sie einen vorbestimmten optimalen Z-Offset. Um die Regionen von Interesse zu detektieren, legen Sie den Scan-Bereich als einzelnen Ort mit 2000 mal 2000 Pixeln ohne Benning fest. Wählen Sie den geeigneten Plattentyp sowie den 488 Nanometer Argonlaser bei Anregung über Emissionswellenlängen von 488 über 525 Nanometern aus.

Wählen Sie anschließend eine Vertiefung mit einem mit dem Fahrzeug behandelten Embryo aus und klicken Sie auf „Probe finden“. Das Gerät führt einen automatischen Fokussier-Scan durch und erfasst ein einzelnes Bild, um die korrekte Bildaufnahme zu bestätigen. Wählen Sie zufällig eine mit dem Fahrzeug behandelte Vertiefung aus und erfassen Sie ein Bild.

Wenn das Bild scharf ist und die GFP-Expression im Kopf zeigt. Positionieren Sie den Cursor über den hellsten Bereichen und überprüfen Sie, ob die Fluoreszenzintensität innerhalb des Bereichs der 16-Bit-Kamera liegt. Weniger als 65.000 Einheiten.

Wiederholen Sie diese Schritte mit einer weiteren Fahrzeugkontrolle und einigen Brunnen, die mit der Testverbindung behandelt wurden. Passen Sie gegebenenfalls die Laserleistung und den Verstärkungsfaktor so an, dass die hellsten Bereiche in den Positivkontrollbildern nicht sättigen. Wählen Sie anschließend im Fenster für die Plattenakquise und -steuerung „Platte akquirieren“, um den Plattenscan zu starten.

Das Instrument erfasst automatisch ein Bild pro Vertiefung für die gesamte Mikroplatte und archiviert diese in einer SQL-Server-Datenbank. Sobald der Scan abgeschlossen ist, laden Sie die Bilder in D definition's Developer hoch, indem Sie Developer mit aktivierter Slinger-Option öffnen.

Erstellen Sie einen neuen Arbeitsbereich. Wählen Sie dann im Dateimenü den benutzerdefinierten Import aus. Navigieren Sie anschließend zu dem Ordner, der die Bilder enthält, und öffnen Sie eine Beispieldatei.

Wählen Sie einen Importfilter aus, der das vom Molecular Devices ImageXpress Ultra-Plattform erzeugte Bildformat und die Dateistruktur erkennt. Öffnen Sie nun ein Kontrollbild, um die gewünschte Cognition Network Technology (CNT) oder den entsprechenden Algorithmus bzw. Regel-Set zur Bildverarbeitung zu laden. Der hier verwendete benutzerdefinierte Algorithmus wurde entwickelt, um Embryo, Dottersack und Kopf automatisch zu identifizieren und Helligkeit sowie Fläche der GFP-exprimierenden Kopfstrukturen zu quantifizieren. Führen Sie das Regel-Set bis zum Schritt der Erkennung von Kopf und Dottersack aus.

Um eine korrekte Zuordnung von Dottersack und Kopf sicherzustellen, passen Sie den Regelsatz an, um die Dottersack-Erkennungsschwelle anzupassen, falls der Dottersack zu groß oder zu klein ist. Führen Sie anschließend den Regelsatz bis zum Stadium der Erkennung heller Kopfstrukturen aus. Um eine korrekte Zuordnung der GFP-exprimierenden Bereiche im Kopf sicherzustellen, modifizieren Sie den Regelsatz, um die Erkennungsschwelle für Kopfstrukturen als Vielfaches der minimalen Intensität anzupassen, bis die Erkennung heller Kopfstrukturen mit der visuellen Beobachtung übereinstimmt.

Als Nächstes führen Sie den gesamten Regelsatz manuell an mehreren zufällig ausgewählten Bildern durch, die von mit Vehicle behandelten Embryonen sowie von positiven Kontrollbildern aus mit PCI behandelten Embryonen stammen. Um den Algorithmus auf allen Plattenbildern auszuführen, wählen Sie die zu analysierenden Platten aus und wählen Sie „Analysieren“. Navigieren Sie anschließend zum optimierten Regelsatz und analysieren Sie alle Wells.

Mithilfe des integrierten Job-Schedulers werden leere Wells oder mehrdeutige Bilder während des Scans automatisch von der Analyse ausgeschlossen. Eine fortlaufend aktualisierte Keep-Map wird angezeigt. Sowohl die Daten als auch die Bilder sind während des Laufs zur visuellen Überprüfung zugänglich.

Die numerischen Daten und verarbeiteten Bilder werden automatisch gespeichert. Nachdem alle Bilder analysiert wurden, können die Daten in Software von Dritten wie Excel, GraphPad oder Prism exportiert werden. Diese Abbildung zeigt archivierte Scan-Bilder aus einer mit Vehicle und einer mit BCI behandelten Probe mit und ohne CNT-Analyse.

Das angewandte grüne Fluoreszenzprotein oder GFP wird im Auge, an der Grenze zwischen Mittel- und Hinterhirn sowie in den Ganglien des Nervus trigeminus transgener Embryonen nachgewiesen. Beachten Sie, dass sowohl die GFP-Intensität als auch die Expressionsbereiche erweitert sind. Bei den hier behandelten BCI-Embryonen ist eine dosisabhängige Wirkung von BCI auf die Expression des GFP-Reportergens in transgenen Embryonen zu beobachten.

Die Konzentration, die erforderlich ist, um eine halbmaximale Wirkung oder EC 50 hervorzurufen, betrug etwa 12 Mikromolar. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man transgene Zebrafischembryonen züchtet, sammelt und in 96-Well-Platten anordnet. Wir haben steigende Konzentrationen von PCI zum eigenen Aktivator des Signalwegs hinzugefügt.

Wir haben außerdem gezeigt, wie die Bildgebung transgener Embryonen automatisiert werden kann, und die Bilder mit einem eigens entwickelten Algorithmus basierend auf Kognitionstechnologie ausgewertet. Mit diesem Ansatz konnten wir die Wirkungen eines kleinen molekularen Aktivators des Fibroblastenwachstumsfaktor-Signalwegs quantitativ und gestuft messen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Embryonen sorgfältig auszuwählen, um die Variabilität zwischen den Proben zu minimieren.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.​