In vivo Quantifizierung der G Protein-gekoppelten Rezeptor-Wechselwirkungen mit spektral aufgelöste Zwei-Photonen-Mikroskopie

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, stöchiometrische und strukturelle Informationen über ein Protein zu gewinnen. Alle Ligament-Komplexe, die lebende biologische Zellen enthalten, werden mithilfe genetisch veränderter Hefezellen hergestellt, die die Proteine von Interesse exprimieren, jeweils verknüpft mit einer Donor- oder Akzeptor-Fluoreszenzsonde. Donor-Sonden können direkt durch einen Laser angeregt werden.

Während Akzeptoren nur durch Energieübertragung von einem benachbarten angeregten Donor angeregt werden können, werden die Zellen einem Licht eines gepulsten Nahinfrarotlasers ausgesetzt. Die Fluoreszenzstrahlung der Sonden wird durch ein Transmissionsgitter in ihre spektralen Komponenten zerlegt und auf die Oberfläche eines elektronenvervielfachenden CCD-Arrays projiziert. Daher werden für jede Position in der Probe vollständige Fluoreszenzspektren einzelner, aller Ligamente erhalten.

Das spektrale Profil der detektierten Fluoreszenz hängt von der spezifischen Wechselwirkung der untersuchten Proteine ab. Die Daten werden analysiert, um für jedes Bildpixel einer gescannten Zelle die getrennten Emissionen der Donor- und Akzeptorsonden zu bestimmen. Die Effizienz des Energietransfers wird für jedes Bildpixel ermittelt, und anschließend werden die Pixel entsprechend ihrer FRET-Effizienz und des Histogramms gruppiert.

Die Histogramminterpretation ermöglicht die In-vivo-Bestimmung von Protein, Komplexgröße und -konfiguration. Hallo, mein Name ist Michael Stoneman von der Riku-Forschungsgruppe an der University of Wisconsin Milwaukee. Mein Name ist Singh.

Ich komme aus dem Rikus-Labor in Milwaukee, Wisconsin. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die vollständigen Emissionsprofile von Hunderten von Ligamentkomplexen innerhalb einer Zelle durch einen einzigen vollständigen Scan der Zelle gewonnen werden. Üblicherweise müssen die meisten Fluoreszenzmikroskopiemethoden die Zelle von Interesse mehrfach scannen, um genügend spektrale Informationen zu sammeln, um die FRET-Effizienz in verschiedenen interessierenden Bereichen innerhalb der Zelle bestimmen zu können.

Jedoch können diffusionsbasierte biochemische Reaktionen die molekulare Zusammensetzung dieser interessierenden Bereiche verändern und dadurch die Informationen, die bei der Aufnahme des Bildes gewonnen werden, begrenzen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Untersuchung von Proteinen und Proteinwechselwirkungen in lebenden Zellen zu beantworten, beispielsweise: Wie groß sind schädliche Oligomere? In welcher Phase des Protein-Lebenszyklus bilden sich die Oligomere, und welche Rolle spielen Oligomere dieses Proteins bei der zellulären Funktion?

Das spektral aufgelöste Zweiphotonen-Mikroskop sammelt spektrale Informationen über die Olima-Komplexe in der Bildzelle, indem der Fokus des Anregungsstrahls an einer Reihe von Positionen über die Probe bewegt wird. Ein Paar orthogonaler Ablenkspiegel wird verwendet, um den Fokus des Laserstrahls in zwei unterschiedlichen Richtungen über die Probe zu verschieben. Die Bewegung der Ablenkspiegel erfolgt computergesteuert und ist synchronisiert mit der Erfassung der Fluoreszenzintensitätsdaten aus der CCD-Kamera; aus den Linienscans können räumliche Fluoreszenzintensitätskarten rekonstruiert werden, die einer bestimmten Wellenlänge des Lichts entsprechen.

Um räumliche Karten der Röntgenfluoreszenzintensität genau rekonstruieren und die tatsächliche Wellenlänge berechnen zu können, die jeder dieser Karten entspricht, muss das Zeilenscan-Protokoll mithilfe einer Fluoresceinlösung kalibriert werden. Um mit der Kalibrierung zu beginnen, senden Sie ein Signal zur Anregungsspektrenmessung bei einer Wellenlänge von 800 Nanometern, was dem Zweifachen der maximalen Anregungs-Wellenlänge des Donor-Farbstoffs GFP zwei zwei entspricht. Senden Sie zur Anregungsspektrenmessung das Prisma, das sich innerhalb des Laserresonators befindet, um die Gruppengeschwindigkeitsdispersion mittels des Computerprogramms zu verändern, mit dem die Kamera verbunden ist. Senden Sie einen Befehl an den CCD-Chip, um die Temperatur des CCD-Chips auf den niedrigst möglichen Wert abzusenken.

Um das Dunkelrauschen zu reduzieren, pipettieren Sie 10 Mikroliter Fluoresceinlösung auf einen Mikroskopobjektträger und bedecken Sie diesen mit einem Deckglas, sodass sich eine dünne Schicht der Probe gleichmäßig im Bereich zwischen Deckglas und Objektträger verteilt. Geben Sie einen kleinen Tropfen Immersionsöl auf die Oberfläche des Deckglases. Befestigen Sie nun den Mikroskopobjektträger auf der XY-, Z-Translationsstufe und verschieben Sie den Objektträger und die Stufe entlang der optischen Achse, indem Sie den linearen Stellantrieb manuell justieren. Verschieben Sie den Objektträger, bis das Mikroskopobjektiv mit dem Tropfen Immersionsöl in Kontakt kommt. Schalten Sie die Kamera in den Videomodus zur Datenaufnahme, sodass das auf das CCD-Array treffende Licht in Echtzeit auf dem Computerbildschirm angezeigt wird.

Schalten Sie alle Umgebungslichter aus, um das am CCD-Array detektierte Hintergrundrauschen zu verringern. Stellen Sie den Mikrometer langsam ein, der die Translationsstufe in Richtung der optischen Achse steuert, um die Probe in den Fokuspunkt des Laserstrahls zu bringen. Wenn die Fluorescein-Probe scharf gestellt ist, erscheint die Emission als scharfe Linie auf dem CCD-Array.

Laden Sie die Ausgabe der Pixelintensitäten vom CCD-Array auf den Computer herunter. Messen Sie die Pixelintensität als Funktion der Position auf dem CCD-Array, indem Sie die heruntergeladene Matrix der Intensitätswerte in ImageJ öffnen und eine Linie durch den fluoreszierenden Bereich ziehen. Verwenden Sie den Image-Day-Befehl.

Analysieren Sie das Profildiagramm, um ein Diagramm zu erstellen, das das Emissionsspektrum der Fluoresceinprobe veranschaulicht. Passen Sie den inkrementalen Parameter des Spiegels an, der die Bewegung des Lasers steuert. Fokussieren Sie in Y-Richtung, sodass benachbarte y-Positionen innerhalb der Probe eine Verschiebung des Peaks der Fluoreszenzspektren um genau ein Pixel entlang der spektralen Dimension auf dem CCD-Array bewirken.

Um dies zu überwachen, laden Sie die Fluorescein-Spektren-Intensität für zwei verschiedene Y-Positionen in der Probe herunter. Öffnen Sie anschließend die Intensitätsbilder mit ImageJ und ermitteln Sie die Position des maximalen Pixels für jedes der Fluoreszenzspektren. Verwenden Sie dazu den ImageJ-Zeiger, lassen Sie den Verschluss der CCD geöffnet und scannen Sie den Laserfokus in X-Richtung über die Probe.

Das von jedem Voxel entlang der Scanlinie emittierte Licht sollte auf das CCD-Array am Ende jedes Zeilenscans auftreffen, die vom CCD-Array für diesen Zeilenscan gewonnenen Daten speichern und anschließend die Pixel des CCD-Arrays löschen. Bewegen Sie die Position des Lasers. Fokussieren Sie in Y-Richtung um den zuvor bestimmten Betrag.

Scannen Sie dann den Laserstrahl in X-Richtung über die Probe. Öffnen Sie erneut den Verschluss des CCD und speichern Sie die Daten. Wiederholen Sie diesen Linienscan-Vorgang, bis ein physischer Bereich, der etwa 50 % größer ist als die Abmessungen einer einzelnen biologischen Zelle, mit Laserlicht beleuchtet wurde.

Die Beziehung zwischen der Zeilennummer eines bestimmten Zeilenscan-Bildes und der Wellenlänge sollte verwendet werden, um die Bilder neu zusammenzusetzen, um mehrere Fluoreszenzintensitätskarten bei verschiedenen Wellenlängen zu erhalten. Um das Fluoreszenz-Emissionsbild für eine bestimmte Wellenlänge zu erhalten, ermitteln Sie die Zeilennummer auf dem Bild, das aus dem ersten Zeilenscan gewonnen wurde und der gewünschten Wellenlänge entspricht. Dann entspricht die benachbarte Zeile des nachfolgenden Zeilenscan-Bildes der nächsten Zeile des Fluoreszenz-Emissionsbildes.

Für diesen speziellen Wellenlängenstapel alle Bildzeilen, die dieser Wellenlänge entsprechen, zusammenführen, um die räumlichen XY-Fluoreszenzintensitätskarten der Probe bei dieser Wellenlänge zu erhalten. Wiederholen Sie dieses Verfahren für alle anderen verfügbaren Wellenlängen, um Daten zu Ihren Proben zu sammeln. Entfernen Sie zuerst die Platten mit transformierten Hefe-Kolonien aus dem Inkubator.

Es sollten mindestens drei Typen transformierter Zellen vorhanden sein. Zellen, die die Proteine von Interesse exprimieren, die mit beiden Typen fluoreszierender Sonden markiert sind. Zellen, die nur Proteine exprimieren, die mit den Donor-fluoreszierenden Sonden markiert sind, und Zellen, die nur Proteine exprimieren, die mit den Akzeptor-fluoreszierenden Sonden markiert sind.

Fügen Sie 100 Mikroliter 100 Millimolar Kaliumchlorid in ein Mikrozentrifugenröhrchen hinzu. Verwenden Sie dann eine Mikropipettenspitze, um drei bis fünf Hefekolonien von der Platte mit Zellen, die mit Donor- und Akzeptor-Fluoreszenzmarkern markierte Proteine exprimieren, abzukratzen und das 100 Millimolar Kaliumchlorid damit zu beimpfen. Entnehmen Sie anschließend 10 Mikroliter der Zellsuspension und geben Sie diese auf ein frisches Objektträgerplättchen.

Bedecken Sie den Tropfen mit einem Deckglas und geben Sie einen Tropfen Öl auf die Oberfläche des Deckglases. Schließen Sie danach manuell den Verschluss im Strahlengang des Laserstrahls, um zu verhindern, dass das Laserlicht das Mikroskopobjektiv erreicht. Befestigen Sie den Objektträger an der XY-, Z-Verfahrbühne und bewegen Sie die Verfahrbühne entlang der optischen Achse, bis das Mikroskopobjektiv mit dem Tropfen Immersionsöl in Kontakt kommt.

Schalten Sie nun die Weitfeld-Beleuchtung ein und wechseln Sie zur Kamera. Videomodus der Datenaufnahme. Das Weitfeld-Bild der Probe wird aufgrund des Vorhandenseins des Transmissionsgitters im Emissionspfad stark unscharf sein.

Platzieren Sie daher einen Bandpassfilter mit einer kleinen Halbwertsbreite im optischen Pfad vor dem Transmissionsgitter. Verschieben Sie langsam die Translationsstufe in Richtung der optischen Achse, während Sie das Bild der Zellen auf dem Kamerabildschirm beobachten, bis die Zellen scharfgestellt sind. Bewegen Sie die Stufe entweder in X- oder Y-Richtung, um eine einzelne Zelle an die Position des Laserstrahlfokus zu bringen.

Schalten Sie die Breitfeld-Beleuchtungsquelle aus und entfernen Sie den Bandpassfilter aus dem Emissionspfad. Entblockieren Sie den Laserstrahl für kurze Zeit, während gleichzeitig das Signal am CCD-Array überwacht wird. Wenn während der Zeit, in der der Laserstrahl auf die Zelle trifft, ein fluoreszierendes Signal am CCD-Array detektiert wird, führen Sie einen vollständigen Fluoreszenz-Datenerfassungs-Scan dieser Zelle durch.

Es ist entscheidend, dieselben Scanparameter zu verwenden, insbesondere die Anzahl der Zeilen und die Inkrementgröße, wie sie im zuvor gezeigten Kalibrierungsverfahren festgelegt wurden. Wiederholen Sie den Vorgang zur Zelllokalisierung und Erfassung der Fluoreszenzdaten für eine große Anzahl von Zellen, die Proteine exprimieren, die sowohl an Donor- als auch an Akzeptortags gebunden sind. Nachdem genügend Fluoreszenzbilder von Zellen gesammelt wurden, die Proteine mit beiden Markierungen exprimieren, wiederholen Sie den gesamten Prozess erneut sowohl für Zellen, die ausschließlich mit Donorfluoreszenzmarkern versehene Proteine exprimieren, als auch für Zellen, die ausschließlich mit Akzeptorfluoreszenzmarkern versehene Proteine exprimieren.

Schließlich alle Scans rekonstruieren, um spektral aufgelöste räumliche XY-Fluoreszenzintensitätskarten für jeden Datensatz zu erhalten, unter Verwendung des zuvor beschriebenen Verfahrens. In diesen drei Abbildungen sind die resultierenden räumlichen Karten dargestellt, die aus spektral aufgelösten Zwei-Photonen-Mikroskopie-Messungen an einer Hefe-Zelle berechnet wurden, die den Steril-Rezeptor für den Alpha-Faktor exprimiert. Zweidimensionale Karten der Donor- und Akzeptorsignale wurden durch die Analyse der spektralen Emissionsprofile gewonnen, die von jeder Position der Zelle stammten.

Den Fluoreszenzintensitäten werden je nach ihren Werten Falschfarben zugeordnet, und die Skala wird als Einlage dargestellt. Anschließend wurde unter Verwendung der KDA- und KAD-Bilder eine zweidimensionale Karte der scheinbaren FRET-Effizienzen berechnet, wobei die Werte aus der Karte der scheinbaren FRET-Effizienzen der Zelle entnommen wurden; gerade wurde ein Histogrammplot erstellt. Die gemessenen EAPP-Werte der Zelle sind durch Kreise dargestellt.

Die rote durchgezogene Linie stellt die beste Anpassung an die gemessenen Daten dar, die mithilfe der Summe der einzelnen Kalziumfunktionen, dargestellt durch durchgezogene grüne Linien, erzielt wurde. Die Analyse des Histogramms, die im Protokolltext beschrieben ist, bestätigt, dass der sterile Two-Alpha-Factor-Rezeptor-All-Ligament-Komplex in vivo die Form eines RBA-förmigen Tetramers annimmt. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von 12 Stunden durchgeführt werden.

Während dieses Experiments ist es wichtig, die Leistung der Anregungsquelle gering zu halten. Es ist entscheidend, eine mehrfache Anregung des Donors durch einen einzelnen Puls zu vermeiden.