Visualisierung der Proteinkinase Eine Aktivität bei kopffixierten Behaving Mäusen mit In Vivo Zweiphotonen fluoreszenz Lifetime Imaging Microscopy
7. Juni 2019
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Ein Verfahren wird vorgestellt, um Proteinkinase-A-Aktivitäten in kopffesten, sich verhaltenden Mäusen zu visualisieren. Ein verbesserter A-Kinase-Aktivitätsreporter, tAKAR, wird in kortikalen Neuronen ausgedrückt und für die Bildgebung durch ein Schädelfenster zugänglich gemacht. Die zweiphotonenfluoreszenzspezifische Bildmikroskopie wird verwendet, um PKA-Aktivitäten in vivo während der erzwungenen Fortbewegung zu visualisieren.
Unsere Methode verwendet eine neuartige Proteinkinase Ein Sensor namens Ziel A Kinase Aktivität Reporter alpha, oder tAKAR
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Übersicht
Diese Studie stellt ein Verfahren zur Visualisierung der Proteinkinase-A-(PKA)-Aktivität in am Kopf fixierten, verhaltenden Mäusen mithilfe eines verbesserten PKA-Aktivitätsreporters, tAKARα, vor. Der Reporter wird in kortikalen Neuronen exprimiert und ermöglicht die Bildgebung durch ein kranielles Fenster unter Verwendung der Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie während der Fortbewegung.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Bildgebende Verfahren
- Proteinkinase-Signalübertragung
Hintergrund
- Die Proteinkinase A spielt eine entscheidende Rolle bei der neuronalen Signalübertragung und Plastizität.
- Das Verständnis der PKA-Aktivität in vivo kann Einblicke in Verhaltensmechanismen ermöglichen.
- Kopffixierte Mäuse erlauben die Beobachtung von Verhaltensweisen, während externe Variablen kontrolliert werden.
- Frühere Bildgebungsverfahren weisen Einschränkungen auf, die diese Studie überwinden möchte.
Zweck der Studie
- PKA-Aktivität bei sich bewegenden Mäusen während der Lokomotion sichtbar machen.
- Eine fortschrittliche Bildgebungstechnik nutzen, um Einblicke in die Dynamik der Signalübertragung im Gehirn zu gewinnen.
- Bewährte Methoden zur Visualisierung von Kinasen-Aktivitäten in lebenden Tieren weiter verbessern.
Verwendete Methoden
- Nutzung der Zweiphotonen-Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebungsmikroskopie als zentrale Bildgebungstechnik.
- Das zentrale biologische Modell beinhaltet die Expression des tAKARα-Reporters in kortikalen Neuronen von fixierten Mäusen.
- Die Mäuse werden einer erzwungenen Fortbewegung unterzogen, um Veränderungen der PKA-Aktivität zu untersuchen.
- Die Bildgebung erfolgt durch ein kraniales Fenster, um Echtzeit-Beobachtungen zu ermöglichen.
Hauptergebnisse
- Die Studie ermöglicht die erfolgreiche Visualisierung und Überwachung der PKA-Aktivität in vivo und demonstriert dynamische zelluläre Signalvorgänge während des Verhaltens.
- Beobachtete Veränderungen der PKA-Aktivität korrelieren mit der Fortbewegung und unterstreichen die mechanistische Rolle der PKA beim Verhalten.
- Die Ergebnisse deuten auf erhebliche methodische Verbesserungen gegenüber früheren Bildgebungsverfahren hin.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie demonstriert einen neuartigen Ansatz zur Visualisierung der PKA-Aktivität, der ein besseres Verständnis der neuronalen Signalübertragung während des Verhaltens ermöglicht.
- Die Ergebnisse haben Auswirkungen auf zukünftige Forschungen zu neuronalen Mechanismen und Plastizität.
- Insgesamt könnten die hier vorgestellten methodischen Fortschritte Studien in der Verhaltensneurowissenschaft verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Welche Vorteile bietet die Verwendung von am Kopf fixierten Mäusen für die PKA-Bildgebung?
Bei fest montierten Mäusen ist eine präzise Kontrolle der Versuchsbedingungen möglich, während gleichzeitig die neuronale Aktivität während natürlicher Verhaltensweisen wie der Fortbewegung untersucht werden kann.
Wie wird der tAKARα-Reporter in den Mäusen exprimiert?
Der tAKARα-Reporter wird in kortikalen Neuronen exprimiert und ermöglicht die Echtzeit-Aufnahme von PKA-Aktivitäten während verhaltensbezogener Aufgaben.
Welche Arten von Daten können mit dieser Bildgebungsmethode gewonnen werden?
Die Methode liefert Daten über die Dynamik der PKA-Aktivität und ermöglicht es Forschenden, die Kinasenaktivität mit spezifischen Verhaltensweisen und neuronalen Reaktionen zu korrelieren.
Kann diese Methode für andere Arten der Kinasen-Bildgebung angepasst werden?
Ja, die Bildgebungstechnik und der Reporterdesign könnten modifiziert werden, um verschiedene Kinasen zu untersuchen, wodurch die Anwendung auf unterschiedliche Signalwege in der Neurowissenschaft erweitert wird.
Welche Einschränkungen hat diese Bildgebungsmethode?
Zu den Einschränkungen zählen mögliche Störungen durch andere zelluläre Signalwege sowie die Notwendigkeit chirurgischer Eingriffe zur Implantation von Schädel-Fenstern.
Wie verbessert die Zweiphotonen-Fluoreszenzlebensdauermikroskopie die Beobachtungen?
Die Zweiphotonenmikroskopie ermöglicht eine tiefere Gewebedurchdringung und verursacht weniger Photodamage, wodurch eine detaillierte Abbildung dynamischer zellulärer Prozesse in vivo ermöglicht wird.
Welche Auswirkungen haben die Ergebnisse für die Verhaltensneurowissenschaften?
Die Ergebnisse liefern Einblicke in die Rolle der PKA bei der neuronalen Signalübertragung während des Verhaltens und könnten zukünftige Forschungsarbeiten zu Lern- und Gedächtnisprozessen beeinflussen.
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Die Visualisierung intrazellulärer Signaltransduktion in verhaltensaktiven Tieren schließt die Lücke zwischen molekularen Mechanismen und verhaltensbezogenen Phänotypen und stellt einen entscheidenden Schritt bei der Zielvalidierung für die Wirkstoffforschung im zentralen Nervensystem dar. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Beobachtung der PKA-Aktivität mit Einzelzellauflösung – einem zentralen Knotenpunkt mehrerer neuromodulatorischer Signalwege – während definierter Verhaltensweisen und liefert so eine mechanistische Entlastung für Zielstrukturen, die upstream der cAMP-Signaltransduktion liegen. Durch die Korrelation der Kinasenaktivität mit der Fortbewegung bei fixierten Mäusen unterstützt dieser Ansatz die Vorhersagbarkeit der Zielstrukturenbindung und der Modulation des Signalwegs und liefert damit entscheidende Informationen für frühe Go/No-Go-Entscheidungen in neuropsychiatrischen Arzneimittelentwicklungsprogrammen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem die PKA-Aktivität als Messgröße für neuromodulatorische GPCR-Signalwege in definierten neuronalen Populationen sichtbar gemacht wird.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die funktionelle Zielvalidierung in intakten neuronalen Schaltkreisen während des Verhaltens und verringert so die mechanistische Uneindeutigkeit bei der Zielwahl.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem eine Verbindung zwischen der Modulation des Zielmoleküls und messbaren Veränderungen der Kinaseaktivität in relevanten Verhaltenszuständen hergestellt wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet validierte biologische Systeme (kortikale Neuronen, die tAKARα exprimieren) für die anschließende Wirkstoff-Screening-Untersuchung gegen neuromodulatorische Zielstrukturen vor.
- Quantitative Ausgabe: Liefert FRET-basierte FLIM-Messsignale, die standardisierte und reproduzierbare Quantifizierung von Veränderungen der PKA-Aktivität als Reaktion auf pharmakologische Störungen ermöglichen.
- Skalierbarkeit: Das chronische Schädel Fenster und die fixierte Kopfposition erlauben wiederholte Bildgebungssitzungen und unterstützen damit die longitudinale Beurteilung der Wirkstoffeffekte auf die Signalübertragungsdynamik.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Anwendbar zur Untersuchung einer Dysregulation der PKA in Modellen neuropsychiatrischer Erkrankungen, bei denen die neuromodulatorische Signalübertragung beeinträchtigt ist.
- Translationskontinuität: Verbindet die entdeckungsphasenbasierte Zielvalidierung mit der präklinischen Wirksamkeitsprüfung, indem eine konsistente Erfassung der Signalwegaktivität über alle Phasen hinweg gewährleistet wird.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Ermöglicht eine frühe Beurteilung, ob Wirkstoffkandidaten ihre Zielstrukturen ansprechen und die downstream gerichtete Signalübertragung in Verhaltensmodellen aktivieren, und liefert damit Hinweise zur Dosisauswahl sowie zu mechanismenbasierten Biomarkern.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der Testung von Zielhypothesen über die Identifizierung von Leitstrukturen bis hin zur präklinischen Validierung ein und bietet einen mechanistischen Endpunkt, der die Entscheidungen über die Weiterentwicklung in jeder Phase unterstützt.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch Visualisierung von Veränderungen der PKA-Aktivität als Reaktion auf die Freisetzung von Neuromodulatoren oder die Manipulation von Rezeptoren während des Verhaltens.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft von Assays zur Bewertung der Wirkung von Substanzen auf die cAMP/PKA-Signalübertragung in neuronalen Netzwerken mit zellulärer Auflösung.
- Analytik: Erzeugt quantitative, auf FLIM-basierende FRET-Messungen, die den Vergleich von Signalübertragungsdynamiken zwischen verschiedenen Bedingungen, Genotypen oder Behandlungen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet mit präklinischen Arbeiten, indem sie einen übertragbaren Endpunkt für die Aktivierung von Signalwegen bereitstellt, der in Biomarker-Strategien widergespiegelt werden kann.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Untersuchung mehrerer neuromodulatorischer Zielstrukturen, die auf PKA wirken, anwendbar über verschiedene Hirnregionen und Verhaltensparadigmen hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Liefert eine verlässliche Vorhersage über den Zielmechanismus, indem die Kinasenaktivität direkt als funktioneller Endpunkt der Signalwegmodulation sichtbar gemacht wird.
- Operationaler Wert: Standardisiert die Messung intrazellulärer Signalübertragung mithilfe genetisch kodierter Sensoren und FLIM und verringert so die Variabilität bei der Beurteilung von Signalwegen.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten, indem die Zielstrukturenbindung mit nachgeschalteten Signaländerungen in relevanten Verhaltenskontexten verknüpft wird.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Wirkstoffen basierend auf ihrer Fähigkeit, die PKA-Aktivität in Verhaltensversuchen mit lebenden Tieren zu modulieren, und reduziert so späte Ausfälle aufgrund fehlender Modulation des Ziel-Signalwegs.
Umsetzungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der viralen Vektordarreichung oder der intrauterinen Elektroporation zur neuronalen Expression genetisch kodierter Sensoren.
- Setzt eine Infrastruktur für die Zweiphotonen-Fluoreszenzlebensdauermikroskopie sowie Expertise in der FLIM-Datenaufnahme und -analyse voraus.
- Benötigt standardisierte Protokolle für die Vorbereitung fixierter Tiere, das Verhaltens-Training und die Pflege chronischer Fenster, um die Reproduzierbarkeit über verschiedene Studien hinweg sicherzustellen.
- Erfordert Anpassungen, wenn die Methode auf andere Hirnregionen oder Verhaltensassays über die Lokomotion hinaus angewendet wird.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die chirurgische Komplexität und mögliche Variabilität der Sensor-Expressionsniveaus, die für quantitative Vergleiche kontrolliert werden müssen.
Biopharma-Häufig gestellte Fragen
Warum ist die Nullhypothesenprüfung für die Zielvalidierung wichtig, wenn die PKA-Aktivität visualisiert wird?
Die Nullhypothesentestung ermittelt, ob beobachtete Veränderungen der PKA-Aktivität während des Verhaltens statistisch signifikant sind und nicht auf zufällige Schwankungen zurückgehen, und liefert so belastbare Hinweise auf die Zielstrukturenbindung und die Modulation des Signalwegs in präklinischen Studien.
Wie passt die Isolierung der unabhängigen Variablen in die Entdeckungspipeline für PKA-Bildgebungsstudien ein?
Die Isolierung unabhängiger Variablen wie der gezielten Freisetzung von Neuromodulatoren oder der Aktivierung von Rezeptoren ermöglicht es Forschern, Veränderungen in der PKA-Aktivität definierten Zielstrukturen zuzuordnen und trägt so zur mechanistischen Ent风险bewertung in der frühen Entdeckungsphase bei.
Welche quantitativen abhängigen Variablenmessungen ermöglichen die Beurteilung der PKA-Aktivität in verhaltensaktiven Mäusen?
Über die Zwei-Photonen-FLIM gemessene FRET-Änderungen liefern quantitative Aussagen über die Dynamik der PKA-Aktivität und ermöglichen die Korrelation mit Verhaltenszuständen und pharmakologischen Interventionen.
Warum sind Anforderungen an die Reproduzierbarkeit für die Zusammenarbeit über Fachbereiche hinweg bei PKA-Bildgebungsworkflows wichtig?
Die Replikation stellt sicher, dass die PKA-Aktivitätsmessungen zwischen Tieren, Sitzungen und Laboren konsistent sind, was für einen zuverlässigen Datenaustausch zwischen Entdeckungs-, präklinischen und translationsorientierten Teams unerlässlich ist.
Welche statistischen Analysefähigkeiten sind erforderlich, bevor die PKA-FLIM-Bildgebung in der Arzneimittelforschung implementiert wird?
Es sind Fähigkeiten zur Analyse von zeitlichen FRET-Daten, zum Vergleich von Verteilungen unter verschiedenen Bedingungen sowie zur Modellierung der Beziehungen zwischen Kinaseaktivität und Verhalten erforderlich, um aussagekräftige Erkenntnisse aus Bildgebungsdatensätzen zu gewinnen.
Chapters in this video
0:04
Title
1:06
Motorized Treadmill Construction
3:22
In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging (2pFLIM) Microscopy
6:29
2pFLIM Image Analysis
8:38
Results: Representative 2pFLIM Data Quantification and Targeted A-Kinase Activity-reporter-alpha (t-AKAR-alpha) Tracking
9:29
Conclusion
