Assaying β-Amyloid-Toxizität mit Hilfe eines transgenen C. elegans Modell

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Toxizität des Beta-Amyloid-Peptids in einem In-vivo-Modellsystem zu untersuchen. Die Reproduzierbarkeit und relative Einfachheit dieses Assays ermöglicht eine schnelle Prüfung von Wirkstoffen, Umweltbedingungen oder genetischen Modifikationen hinsichtlich ihrer Wirkung auf die Toxizität von Beta-Amyloid. Ein entscheidender Faktor bei der Entwicklung dieses Assays ist die Erzeugung transgener C. elegans-Würmer mit muskelspezifischer, temperaturinduzierbarer Expression des Beta-Amyloid-Peptids.

Dieser temperatursensitive Expressionsmechanismus wird durch die Konstruktion eines Transgens erreicht, das einen ungewöhnlich langen drei-primär-unübersetzten Bereich enthält, wodurch die Transgen-mRNA ein Ziel der mRNA-Überwachung wird. Die Expression dieses Transgens ist daher in Wildtyp-Würmern mit einem funktionsfähigen mRNA-Überwachungssystem aufgrund des Abbaus der Transgen-mRNA gering. Wenn dieses Transgen in einen genetischen Hintergrund eingeführt wird, der eine Mutation in einer essentiellen Komponente des mRNA-Überwachungssystems aufweist, wird die Transgenexpression deutlich höher sein. Enthält der genetische Hintergrund eine temperatursensitive Mutation im mRNA-Überwachungssystem, so führt die Züchtung dieses transgenen Stammes bei der nicht-permissiven Temperatur zum Block des Abbaus der transgenen mRNA und resultiert in einer hohen Expression des Transgens. Transgene Würmer, die dieses System zur Regulation der Expression des Beta-Amyloid-Peptids in den Körperwandmuskeln nutzen, zeigen nach einer Temperaturerhöhung von 16 Grad Celsius auf 25 Grad Celsius eine starke Anreicherung des Beta-Amyloid-Peptids, Dysfunktion der Muskelzellen und Lähmung der Würmer. Die Messung der Zeit bis zum Eintritt dieser Effekte...

Es bedarf einer Population dieser trenchgenen Würmer, um nach einer Temperaturerhöhung gelähmt zu werden. Der Upshift ist ein empfindlicher Test für die Toxizität von Beta-Amyloid. Dies wird erreicht, indem frische Nematoden-Wachstumsmedienplatten für den Lähmungstest hergestellt werden, was dazu beiträgt, Umweltfaktoren zu minimieren, die die Lähmungsraten beeinflussen können.

Als zweiten Schritt werden alterssynchronisierte Populationen transgener Würmer hergestellt, um die Auswirkungen des Entwicklungsstadiums auf die Transgenexpression zu minimieren. Anschließend werden synchronisierte Larven im dritten Larvenstadium von 16 Grad Celsius auf 25 Grad Celsius hochgeschaltet, wodurch die Stabilität der Transgen-mRNA erhöht und die Anreicherung des Beta-Amyloid-Peptids begünstigt wird. Die Messung der Zeit vom Hochschalten bis zur Lähmung jedes einzelnen Wurms erfasst die Rate der Muskelbeeinträchtigung und ermöglicht so die Untersuchung der toxischen Wirkung der Anreicherung von Beta-Amyloid-Peptid. Auf diese Weise erhält man Ergebnisse, die den Einfluss spezifischer Behandlungen auf die Toxizität des endogen exprimierten Beta-Amyloid-Peptids zeigen.

Der Hauptvorteil unserer Technik im Vergleich zur Verwendung transgener Mausmodelle zur Untersuchung der Wirkstoffaktivität liegt also darin, dass wir sie viel schneller und deutlich kostengünstiger durchführen können. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend. Das Auswerten von L4-Würmern in einem Lähmungsassay ist sehr schwierig zu erlernen.

Wenn Sie einen gelähmten L4-Wurm bewerten, sollten Sie auf die isolierte Halo-Bewegung des Kopfbereichs des Wurms achten. Sobald dieser sich bewegt und der gesamte Körper des Wurms gelähmt ist, wird der Wurm als gelähmt gewertet. Lähmungstests werden auf Platten mit standardisiertem Nematoden-Wachstumsmedium oder NGM durchgeführt, das üblicherweise für die Züchtung und Genetik von C. elegans verwendet wird.

Um die Platten vorzubereiten, sterilisieren Sie die NGM-Lösung, die Natriumchlorid, Agar und Peptid enthält, in einer Erlenmeyerkolben, und geben Sie anschließend die entsprechenden Mengen der folgenden sterilen Lösungen hinzu, die in der beigefügten schriftlichen Anleitung angegeben sind. Portionieren Sie jeweils 10 Milliliter flüssiges NGM in jede 60 Millimeter mal 15 Millimeter große Petrischale. Lassen Sie das NGM über Nacht bei Raumtemperatur erstarren.

Wenn die Wirkung von Verbindungen oder Extrakten getestet wird, aliquotieren Sie den Extrakt auf jede Platte und verwenden Sie einen Verteiler, um ihn gleichmäßig über die Oberfläche der Platte zu verteilen. Lassen Sie die Platten über Nacht bei Raumtemperatur trocknen. Volumina über einem Milliliter benötigen länger zum Trocknen.

Besprühen Sie anschließend jede Platte mit 250 Mikrolitern E. coli-Stamm OP50, der über Nacht in LB-Medium auf eine optische Dichte von 0,4 bis 0,6 gezüchtet wurde, und lassen Sie die Bakterien über Nacht bei Raumtemperatur trocknen. Das Alter der Platte hat einen erheblichen Einfluss auf die Lähmungsrate, wobei ältere Platten dazu neigen, auszutrocknen. Die Platten sollten innerhalb einer Woche nach dem Gießen für den Lähmungstest verwendet werden.

Im Idealfall sollten Sie Platten verwenden, die drei bis vier Tage vor der synchronen Eiablage vorbereitet wurden. Alle in einem Experiment verwendeten Platten sollten aus derselben Charge stammen. Eine Veränderung der Größe des Bakterienrasens und/oder der Bakterienstämme beeinflusst ebenfalls das Verhalten der Würmer. Paralyse-Assays können mit alternativen Stämmen von E. coli durchgeführt werden. Beispielsweise wird HT115 in RNAi-Experimenten verwendet. Dies kann jedoch die Kinetik des Paralyse-Assays verändern.

Daher müssen Sie interne Kontrollen verwenden, die für den jeweiligen Stamm geeignet sind. CL 476 wird am häufigsten zur Untersuchung einer Beta-induzierten Paralyse eingesetzt. Dieser Stamm und andere transgene Modelle sind für akademische Forscher gegen eine geringe Gebühr vom Saint Ahadi Genetic Center erhältlich.

Um die Alterssynchronität der Testpopulation zu maximieren, ist es vorzuziehen, mit einer synchronisierten Elterngeneration zu beginnen. Eine Woche vor dem Start des Paralyseassays der Testpopulation übertragen Sie mit einem Platin-Wurmabstreifer 20 bis 30 gravide adulte Tiere auf mehrere 10 cm NGM-Platten.

Verteilen Sie OP 50 für eine zweistündige Eiablage bei 16 Grad Celsius, was die permissive Temperatur für CL 4 1 76 ist. Entfernen Sie die GR-Erwachsenen und lassen Sie die Nachkommen sieben Tage lang wachsen, wodurch sie am zweiten Tag erwachsene Gravitätstiere sein werden. Zweiter Tag Gravitation.

Erwachsene werden verwendet, um für jede experimentelle Bedingung alterssynchrone Testpopulationen herzustellen. Das Ziel besteht darin, dreifach durchgeführte Platten mit 50 bis 75 alterssynchronen Würmern mithilfe eines Platin-Wurm-Pickers herzustellen. Übertragen Sie 10 bis 12 frisch geschlüpfte erwachsene Würmer auf 60 Millimeter große NGM-Platten, die mit OP50 beimpft sind. Lassen Sie die Würmer zwei Stunden lang bei 16 Grad Celsius Eier legen, entfernen Sie danach die erwachsenen Würmer und lassen Sie die Eier bei 16 Grad Celsius ausschlüpfen und wachsen.

An diesem Punkt ist es am besten, wenn eine Person, die die Platten nicht auswerten wird, diese codiert, sodass die Auswertung blind gegenüber den experimentellen Bedingungen erfolgt. Der Entwicklungsstadium der Embryonen zum Zeitpunkt der Eiablage, das unter optimalen Bedingungen für Wildtyp-Würmer etwa dem 26-Zell-Stadium entspricht, hängt vom Alter und der Ernährung der erwachsenen Tiere ab. Wenn die erwachsenen Würmer, von denen die Eier stammen, älter sind oder verhungert wurden, werden später entwickelte Eier abgelegt, und es kann keine synchronisierte Population erreicht werden, was die Kinetik des Lähmungsassays beeinträchtigt.

Es ist unerlässlich, monogene Bakterienkulturen wie e coli, OP 50 zu verwenden, da jegliche bakterielle Kontamination diesen Assay erheblich beeinträchtigen kann. Die Reproduzierbarkeit ist am höchsten, wenn Ihre Tripelplatten eine ähnliche Anzahl von Würmern aufweisen, um das Transgen zu induzieren und den Lähmungsassay durchzuführen. Inkubieren Sie die Platten bei 25 Grad Celsius.

48 Stunden nach dem Ende der synchronen Eiablage sollten die Würmer im dritten Larvenstadium sein. Die Platten sollten unge stapelt in einem 25 Grad Celsius warmen Inkubator angeordnet werden, damit die Platten diese Temperatur erreichen können. Gleichzeitig sollte die Erfassung der Lähmung der Würmer 18 bis 20 Stunden nach Beginn der Temperaturerhöhung begonnen werden.

Zu diesem Zeitpunkt sollten alle Würmer der Population das vierte Larvenstadium erreicht haben. Setzen Sie die Auswertung im Zwei-Stunden-Takt fort, bis alle Würmer auf jeder der Platten gelähmt sind. Aus unbekannten Gründen ist die Lähmung entlang der Körperlänge nicht gleichmäßig. Der Kopfbereich ist der letzte Teil des Wurms, der die Bewegung einstellt.

Daher können Würmer, die kürzlich mit der Lähmung begonnen haben, sich nicht über die Platte bewegen, aber sie können ihre Köpfe bewegen, wodurch sie die Bakterien um ihre Vorderseite herum entfernen und einen Halo aus abgeräumten Bakterien hinterlassen. Diese Würmer werden zwangsläufig vollständig gelähmt sein, weshalb Würmer mit einem solchen Halo als gelähmt klassifiziert werden. Einige Würmer weisen keinen Halo auf, zeigen aber ebenfalls keine spontane Bewegung.

Sie werden getestet, indem man sie mit dem Wurmpicker anstößt. Wenn eine ange stupste Wurmwesen keine vollständige Körperwellenpropagation nach dem Anstupsen durchführen kann, wird sie ebenfalls als gelähmt gewertet, um eine effiziente Auswertung zu ermöglichen. Am einfachsten ist es, die gelähmten Würmer in einen unbestrichenen Bereich der Platte zu verlegen, damit sie während der nächsten Auswertungsperiode nicht versehentlich erneut bewertet werden.

Dies ermöglicht es auch falsch klassifizierten Würmern, Bewegungen zu zeigen, sodass eine Korrektur der Bewertung erfolgen kann, um eine Lähmungskurve zu erstellen. Zu jedem Zeitpunkt wird der Anteil der Würmer auf jeder Platte, die noch nicht gelähmt sind, in Prozent umgerechnet, und der durchschnittliche nicht gelähmte Prozentsatz wird über der Zeit seit Beginn des Hochschaltens aufgetragen. Die resultierende Kurve ist formal analog zu einer Überlebenskurve und kann daher mithilfe standardmäßiger nichtparametrischer Überlebensstatistiken analysiert werden.

Die Hochschaltung der transgenen myo drei A beta Würmer muss bis zum mittleren L4-Stadium erfolgen, damit die Lähmung einsetzen kann. Der Myo-drei-Promotor wird entwicklungsgesteuert reguliert. Sobald die Würmer das späte L4-Stadium oder das Erwachsenenstadium erreicht haben, ist der Expressionspegel deutlich gesunken.

Die Expression des Transgens wird blockiert, wenn die Würmer verhungern, daher ist es äußerst wichtig, dass die Würmer während des gesamten Experiments gut gefüttert werden. Wir haben nie beobachtet, dass sich ein gelähmter Wurm unter irgendwelchen Bedingungen erholt. Nach 12 bis 16 Stunden Upshift wird CL 41 76 gelähmt sein, unabhängig davon, ob man auf 16 Grad herunterreguliert; bei Stamm CL 41 76 kann die Hochregulation der Transgenexpression, die zur Lähmung führt, bei niedrigeren Temperaturen auftreten.

Beachten Sie jedoch, dass sich die Paralyserate in ihrer zeitlichen Abfolge ändert. Die Paralyserate hängt von der verwendeten spezifischen Transgen-Sorte ab. Wir haben myo-drei-A-beta-Sorten konstruiert, die eine schnellere und langsamere Paralyserate im Vergleich zu CL4176 aufweisen, weshalb Sie Ihr Auswertungszeitfenster für den Paralysetest entsprechend anpassen müssen.

Hier ist ein Diagramm einer Lähmungskurve für CL 4 1 76 gezeigt, sowohl unbehandelt als auch nach Exposition gegenüber 6,27 Millimolar Koffein. Diese Behandlung führt zu einer statistisch hochsignifikanten Verzögerung der Lähmung um etwa vier Stunden, was wir als Hinweis auf eine Unterdrückung der Beta-Toxizität interpretieren. In diesem Modell wurde mit diesem Experiment die Wirkung eines weiteren in Kaffee enthaltenen Verbindungsstoffes untersucht.

Die Kurve ist typisch für Behandlungen, die keine Wirkung auf eine Beta-Toxizität haben. Beachten Sie, dass in beiden Experimenten etwa die Hälfte der unbehandelten CL 4 1 76-Populationen nach 24 Stunden gelähmt ist und die Lähmung nach 28 Stunden vollständig ist. Dies sind typische Zeitrahmen für die Lähmung der Kontrollen.

Bei Populationen von CL 4 1 7 6 weisen signifikante Abweichungen von diesem Zeitpunkt auf veränderte Umweltbedingungen oder einen spontanen Verlust von Transgenkopien hin. Weitere Informationen über den Stamm CL 4 1 76 finden Sie im begleitenden Protokoll. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, das Alter der Platten, das Entwicklungsstadium der Wurmpopulation und die Fähigkeit zur Erfassung der Lähmungsrate der Würmer zu berücksichtigen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie Sie dieses Sea Elgan-System verwenden können, um die Toxizität von Beta-Amyloid sorgfältig zu untersuchen. Sie sollten in der Lage sein, recht subtile Effekte dieser Toxizität durch verschiedene Umwelt- oder Wirkstoffbehandlungen nachzuweisen. Die Variablen, über die wir gesprochen haben, sind wichtig, da sie es Ihnen ermöglichen, den Assay sehr reproduzierbar durchzuführen und eine konsistente Paralyse-Kinetik zu erzielen.

Dies ist tatsächlich sehr wichtig, wenn Sie Ihre in Ihrem Labor zu verschiedenen Zeitpunkten und von verschiedenen Personen erhaltenen Ergebnisse vergleichen möchten oder Ihre Ergebnisse mit denen anderer Forscher, die dieses Modellsystem verwenden, vergleichen wollen.