Membranpotentiale, Synaptic Responses, neuronalen, Neuromodulation und Muscle Histologie Mit dem Crayfish: Schülerlabor Übungen

Die allgemeinen Ziele der folgenden Experimente bestehen darin, die Eigenschaften erregbarer Membranen und die ionische Grundlage des Ruhepotentials der Membran zu verstehen sowie Methoden zur Messung des Membranpotentials zu erlernen und die Eigenschaften der synaptischen Übertragung zu demonstrieren. In einem Teil des Experiments wird das Ruhepotential der Membran gemessen, während die extrazelluläre Kaliumkonzentration verändert wird. In einem anderen Teil des Experiments werden die Mechanismen der synaptischen Differenzierung untersucht, indem stimulierte synaptische Antworten in verschiedenen motorischen Einheiten aufgezeichnet werden.

Danach wird ein leicht zu pflegendes neuronales Netzwerk vorgestellt. Diese Präparation kann sowohl für Lehrzwecke als auch zur Untersuchung verschiedener Aspekte einer sensorischen Reizweiterleitung über das zentrale Nervensystem zu motorischen Neuronen und Muskel verwendet werden. Diese Versuchsreihe zeigt, wie einfach das Modell des Flusskrebses genutzt werden kann, um Fragen zur Membranpotentialintegration, synaptischen Übertragung und strukturellen Unterschieden der Muskelfasertypen zu untersuchen.

Die Hauptvorteile der Verwendung der Krebspräparation beim Lehren elektrophysiologischer Konzepte und Techniken liegen in der einfachen Dissektion, der Lebensfähigkeit der Präparation in minimaler Salzlösung, der einfachen Erfassung synaptischer Antworten und der leichten Erkennbarkeit der gesamten anatomischen Anordnung der Muskulatur. Diese Techniken können auch auf andere Präparationen angewendet werden und tragen zum besseren Verständnis der synaptischen Physiologie und Modulation sowie biochemischer und struktureller Unterschiede in der demonstrierten Präparation bei. Um die Operation zu beginnen, wählen Sie einen Krebs mit einer Körperlänge von etwa sechs bis zehn Zentimetern aus und legen Sie ihn fünf Minuten lang in zerstoßenes Eis, um ihn zu betäuben. Um den Krebs zu enthaupten, halten Sie ihn am Hinterkopf fest und achten Sie darauf, Ihre Finger außerhalb der Reichweite der Scheren und des Mundes des Krebses zu halten, und verwenden Sie dazu große Scheren.

Entfernen Sie den Kopf schnell, indem Sie einen sauberen Schnitt hinter den Augen der Krebsschere ausführen, und entfernen Sie die Beine und Scheren der Krebsschere, um Verletzungen zu vermeiden. Entfernen Sie die Goniopoden bei Männchen sowie die Schwimmfüßchen sowohl bei Männchen als auch Weibchen. Entsorgen Sie den Kopf und die Anhänge.

Als Nächstes trennen Sie den Abdomen vom Thorax, indem Sie einen Schnitt entlang der Gelenkmembran ausführen, die Abdomen und Thorax verbindet. Bewahren Sie den abdominellen Teil der Krebsschere auf und entsorgen Sie den Thorax. Richten Sie die Schere leicht nach unten zur ventralen Seite und unter einem Winkel, und führen Sie entlang der unteren lateralen Begrenzung jeder Seite des Abdomens einen Schnitt in die Schale ein. Achten Sie darauf, nicht zu tief in die Krebsschere hineinzuschneiden.

Folgen Sie mit der Pinzette dem natürlichen Musters der Linien des Krebspanzers, die sich über die Länge jedes Segmentes erstrecken. Entfernen Sie den ventralen Teil des Panzers, indem Sie ihn nach oben und nach hinten ziehen, wobei Sie darauf achten, die Bauchmuskulatur nicht zu beschädigen.

Entfernen Sie die Beugemuskulatur. An dieser Stelle ist ein weißes Gewebemassengewebe auf den tiefen Beugemuskeln sichtbar. Entfernen Sie dieses Gewebe vorsichtig mit einer Pinzette.

Der Verdauungstrakt ist nun als kleines Röhrchen sichtbar, das entlang der Mittellinie der tiefen Beugemuskulatur verläuft. Entfernen Sie ihn, indem Sie ihn mit der Pinzette an der Spitze anfassen und von der Bauchhöhle wegziehen. Durchtrennen Sie das untere Ende des Verdauungstrakts am Schwanzende.

Spülen Sie die Präparation mit Kochsalzlösung, um sicherzustellen, dass fäkale Rückstände die Präparation nicht beeinträchtigen. Befestigen Sie mit Hilfe von Präparationsnadeln die oberen und unteren Ecken der Präparation an einer mit S-Schild beschichteten Petrischale. Die Bauchstreckmuskulatur ist nun freigelegt.

Geben Sie Kochsalzlösung in die Petrischale, um die Präparation zu bedecken, bis intrazelluläre Ableitungen durchgeführt werden. Stellen Sie die Petrischale unter das Mikroskop und verwenden Sie Wachs unterhalb der Schale, um ein Verrutschen zu verhindern. Die für intrazelluläre Ableitungen verwendete Apparatur ist in dieser Abbildung dargestellt.

Die geeigneten Anschlüsse und Einstellungen sind im begleitenden Text angegeben. Richten Sie die Labordiagramm-Software gemäß den Anweisungen ein. Legen Sie im begleitenden Text den Erdungsdraht in das Salzbad.

Bringen Sie die Spitze einer Glas-Mikropipette, die mit drei Mol Kaliumchlorid gefüllt ist, in das Salzlösungsbad ein und prüfen Sie den Elektrodenwiderstand. Der Elektrodenwiderstand sollte zwischen 20 und 60 Megaohm liegen. Verwenden Sie den Grobregler am Verstärker, um die Linie auf dem Aufzeichnungsdiagramm unter starker Beleuchtung auf Null zu stellen.

Sehen Sie durch das Mikroskop und identifizieren Sie die longitudinalen DEM-Muskeln. Verwenden Sie die Elektrodensonde, um die intrazelluläre Elektrode in eine Muskelzelle des DEM-Muskels einzuführen. Die Elektrode sollte gerade tief genug in die Muskelzelle eingeführt werden.

Seien Sie vorsichtig und vermeiden Sie es, die Zelle vollständig zu durchdringen. Messen Sie die Amplitude des Ruhepotentials. Ziehen Sie den M-Marker aus der linken unteren Ecke des Diagrammfensters auf die Spur.

Platzieren Sie die Markierung M auf der Basislinie und bewegen Sie den Cursor zum tiefsten Punkt des aufgezeichneten Signals. Die Differenz zwischen der Markierung und dem aktiven Cursor wird in der oberen rechten Bildschirmecke angezeigt. Dieser Wert entspricht der Spannung des Ruhe­membran­potentials.

Teilen Sie die aufgezeichnete Spannung durch den Verstärkungsfaktor; in diesem Fall wurde eine 10×-Verstärkung verwendet. Wandeln Sie anschließend die Spannung von Volt in Millivolt um. Nachdem das Ruhepotential für diese Muskelzelle aufgezeichnet wurde, betrachten Sie durch das Mikroskop und entfernen Sie die Elektrode vorsichtig aus der Muskelzelle.

Wiederholen Sie die intrazelluläre Ableitung an anderen Muskel­fasern. Im nächsten Teil dieses Experiments wird der Einfluss einer erhöhten extrazellulären Kalium­konzentration auf das Ruhe­membran­potential untersucht. Sechs Salzlösungen für Krebse mit Kalium­konzentrationen von 5,4, 20, 40, 60, 80 und 100 Millimolar werden verwendet.

Wählen Sie einen Muskel aus, der nicht zuckt, um die nächste intrazelluläre Ableitung zwischen den Ableitungen durchzuführen. Ersetzen Sie die Badlösung durch die nächsthöhere Konzentration der Kaliumchloridlösung. Achten Sie jedes Mal darauf, das Präparat vollständig zu bedecken.

Notieren Sie die Änderungen des Membranpotentials für jede Lösung. Der Effekt einer erhöhten extrazellulären Kaliumkonzentration, das Membranpotential, ist in dieser Bildschirmaufnahme dargestellt. Die Ruhepotentiale für jede Kaliumkonzentration werden in einer Halblogarithmischen Auftragung der extrazellulären Kaliumkonzentration gegen das Membranpotential gezeigt. Richten Sie das Ruhepotential bei 5,4 Millimolar extrazellulärem Kalium aus.

Bei den hypothetischen und beobachteten Kurven vergleichen Sie die Steigung der beobachteten Linie mit der Steigung der hypothetischen Linie. Nach Abschluss dieser elektrophysiologischen Ableitungen folgt als nächster Schritt die Untersuchung der Anatomie der Muskel­fasern und ihres Innervationsmusters. Überführen Sie das Präparat in die Stehschale und geben Sie Methylenblau hinzu.

Nach fünf Minuten das Methylenblau entfernen und frische Krebs-Salzlösung hinzufügen. Suchen Sie nach dem Hauptnerv, der die Muskeln innerhalb eines Segmentes innerviert. Skizzieren Sie das Innervationsmuster zu den S-E-M-D-E-L 2D EL eins und DEM Muskeln in einem Segment.

Befördern Sie die Probe anschließend unter eine Abzugshaube. Entfernen Sie die Salzlösung und geben Sie das Fixans mittel hinzu. Als Fixans wird hier eine Poin-Lösung verwendet.

Der Zweck der Abzugshaube besteht darin, die Dämpfe des Fixierungsmittels zu vermeiden. Achten Sie sorgfältig darauf, dass diese Lösung nicht auf die Haut oder in die Augen gelangt. Wenn Ihre Augen zu brennen beginnen, spülen Sie sie unverzüglich an der Augendusche aus.

Lassen Sie die Boin-Lösung etwa 10 Minuten lang auf der Probe, und tauschen Sie sie anschließend mit einer Pipette gegen Kochsalzlösung aus. Schneiden Sie ein dünnes Segment des DEL-eins- oder DEL-zwei-Muskels aus. Legen Sie es auf einen Objektträger.

Beschriften Sie den Objektträger. Wiederholen Sie den Vorgang für den SEM-Muskel. Verwenden Sie das Verbundmikroskop, um das Streifungsmuster der Sarkomere in beiden Gewebeproben zu betrachten.

Die nächste Versuchsreihe untersucht, wie man synaptische Antworten in den Bauchmuskeln von Krebsen aufzeichnet. Wählen Sie einen weiteren Krebs aus und entfernen Sie dessen Kopf. Entfernen Sie den Thorax und die Anhänge und legen Sie die extensor-Muskeln des Abdomens frei, wie in der chirurgischen Darstellung gezeigt.

Im ersten Abschnitt dieses Videos finden Sie mithilfe des Mikroskops den Nerv, der die motorischen Axone zu den Strecker-Muskeln führt. Suchen Sie nach dem Segment mit dem am besten zugänglichen Nerv. Der Nerv ist weiß und kann sichtbar gemacht werden, indem man mit einer Pipette Salzlösung auf das Präparat sprüht oder leicht auf das Präparat bläst.

Dies bewirkt, dass sich der Nerv bewegt und somit leichter identifizierbar ist. Positionieren Sie die vom Mikromanipulator gehaltene Saugelektrode direkt über dem Nerv. Ziehen Sie vorsichtig am Spritzenkolben, um den Nerv in die Elektrode hineinzuziehen.

Sie können sehen, wie der Nerv über das Mikroskop in die Elektrode hineingesaugt wird. Passen Sie die Einstellungen in der Lab-Chart-Software gemäß des begleitenden Artikels an. Füllen Sie eine Glas-Mikroelektrode mit drei Mol Kaliumchlorid und verbinden Sie sie mit der Headstage und dem Powerlab.

Verwenden Sie den Grobregler am Verstärker, um die Linie im Schaubild auf Null zu stellen. Vor dem Einsetzen der Elektrode sollte der Kippschalter mehrmals ein- und ausgeschaltet werden. Um den Elektrodenwiderstand zu testen, messen Sie die Amplitude der resultierenden Werte.

Sehen Sie durch das Mikroskop und verwenden Sie die Elektrodensonde, um die Elektrode in eine der longitudinalen Muskelzellen einzuführen, entweder in DEM oder DL eins oder DL zwei. Achten Sie darauf, die Muskelzelle nicht zu durchbohren. Die Probe ist nun bereit für das Experiment.

Die Saugnadelelektrode dient zur Reizung des segmentalen Nervenbündels, und die Glasmikroelektrode wird verwendet, um die synaptische Antwort von der Muskelzelle aufzuzeichnen, indem der Graft-Stimulator aktiviert wird, um den Nerv mit einem Hertz für phasische Antworten zu reizen. Als Nächstes platzieren Sie die Elektrode in einer SEL-Muskelzelle. Der SEL ist ein tonischer Muskel.

Reizen Sie den Nerv mit kurzen Pulsserien bei 10 Hertz, um tonische Antworten zu erzeugen. Vergleichen Sie die aufgezeichneten Antworten der DEL- und SEL-Muskeln. Beachten Sie, dass die phasischen DEL-Muskeln synaptische Antworten mit größerer Amplitude aufweisen als die tonischen SEL-Muskeln.

Dieser nächste Experimente-Satz konzentriert sich auf die Flexormuskeln der Krebse anstelle der Extensormuskeln. Beginnen Sie mit einem neuen Krebs und isolieren Sie den Abdomen wie in dieser Operation gezeigt. Im ersten Abschnitt dieses Videos platzieren Sie das isolierte Schwanzpräparat in einer mit physiologischer Lösung gefüllten Petrischale und fixieren Sie den Schwanz sowie den oberen Teil des Präparats mit Nadeln.

Beachten Sie, dass bei Decaros Experimenten an den tonischen Flexormuskeln das ventrale Nervenstrang intakt bleiben muss. Verwenden Sie ein Skalpell, um einen Längsschnitt durch die Gelenkmembran zwischen zwei Rippen an der ventralen Seite des Präparats zu beginnen. Achten Sie darauf, beim Anlegen dieses Schnitts nicht zu tief zu schneiden, da ein tiefer Schnitt die motorische Nervenwurzel durchtrennen könnte, um sicherzustellen, dass die oberflächlichen Muskeln nicht beschädigt werden.

Führen Sie den nächsten Schritt durch. Betrachten Sie unter dem Mikroskop die dünne Membranschicht, die den Muskel bedeckt, und schneiden Sie mit einer Schere oder einem Skalpell horizontal von dem Längsschnitt aus, um einen Einschnitt zu erweitern und eine Klappe aus Gelenkmembran zu bilden. Heben Sie die Klappe anschließend nach oben an.

Verwenden Sie eine Schere, um die Klappe zu entfernen, um die oberflächlichen Beugemuskeln für die intrazelluläre Ableitung von den oberflächlichen Beugemuskeln freizulegen. Verwenden Sie dieselben Instrumente und denselben Versuchsaufbau wie für die Ableitung des Ruhepotentials und der synaptischen Antworten von den Bauchstreckmuskeln. Verwenden Sie wie zuvor eine intrazelluläre Elektrode, die mit dreimolarer Kaliumchloridlösung gefüllt ist.

Führen Sie die Elektrode in eine Muskelzelle der oberflächlichen Beugemuskulatur ein, wobei darauf zu achten ist, dass der Muskel nicht durchstoßen wird. Registrieren Sie die spontane Aktivität der EPSPs. Achten Sie auf die unterschiedlichen Größen der EPSPs und darauf, ob IPSPs vorhanden sind.

Nehmen Sie einen kleinen Pinsel und streichen Sie vorsichtig entlang der Cuticulakante innerhalb desselben Segments, das die Ableitelektrode enthält. Achten Sie auf Änderungen in Frequenz oder Größe der EPSPs infolge der Stimulation, falls eine stärkere Reaktion beobachtet wird. Dies würde eine Rekrutierung zusätzlicher motorischer Neurone anzeigen, die auf die veränderte Feuerrate der sensorischen Nerven reagieren.

Tauschen Sie die Salzlösung im Bad vorsichtig gegen eine Lösung aus, die einen Neuromodulator wie beispielsweise einmikromolares Serotonin enthält, oder gegen mit Kohlendioxid durchblubberte Salzlösung. Wiederholen Sie anschließend die Stimulation mit dem Pinsel. Achten Sie darauf, welchen Einfluss der Austausch der Badlösung auf die registrierte Aktivität hat.

Wechseln Sie die Badlösung zurück auf normale Salzlösung und beobachten Sie, dass die Aktivität der Muskelzelle wieder auf den Ausgangswert zurückkehrt. Diese Abbildung zeigt in einer oberflächlichen Flexormuskelzelle aufgezeichnete EPSPs. Achten Sie auf die unterschiedlichen Größen der EPSPs.

Die nächste Phase dieses Experiments verwendet eine extrazelluläre Elektrode, um Aktionspotentiale von Motoneuronen aufzuzeichnen, die auf Aktivität in der sensorischen Reizleitung vom peripheren Nervensystem zum zentralen Nervensystem und weiter zu den Motoneuronen reagieren. Beginnen Sie damit, eine Saug-Elektrode herzustellen, um die sensiblen Nerven zu stimulieren. Ziehen Sie ein Stück Plastikschlauch über eine Flamme.

Der nächste Schritt besteht darin, die Röhre auf die gewünschte Größe zuzuschneiden. Dazu müssen Sie den Nerv in Ihrer Präparation betrachten, um den gewünschten Öffnungsdurchmesser für Ihre Saugelektrode einzuschätzen. Je nach Größe der Krebse können die Nervenbündel im Durchmesser zwischen etwa einem Millimeter und mehreren Millimetern variieren.

Schneiden Sie den gedehnten Abschnitt des Schlauchs ab, um die Öffnung an der Spitze auf die richtige Größe für den Nerv zu bringen. Wenn die Öffnung zu groß ist, könnte der Nerv herausfallen. Wenn die Öffnung zu klein ist, könnte der Nerv durch den Druck der Elektrode beschädigt werden.

Platzieren Sie den Kunststoffschlauch auf der Spitze einer gläsernen Suc-Elektrode. Die Elektrophysiologie- und Softwareeinstellung unterscheidet sich geringfügig von der Überwachung extrazellulärer Antworten im Vergleich zur Einrichtung für intrazelluläre Ableitungen. Gemäß der Ausrüstung, die im begleitenden Artikel spezifiziert ist, saugen Sie die dritte Nervenbahn, die den oberflächlichen Flexormuskel innerviert, in die Saug-Elektrode ein.

Sie können nun mit der Aufzeichnung von Aktionspotentialen beginnen. Diese Bahn verfügt über fünf exzitatorische Motoneurone und ein inhibitorisches Motoneuron. Nach der Aufzeichnung der Grundaktivität stimulieren Sie die Cuticula mit einem Pinsel, um die Veränderung der erzeugten Aktionspotentiale zu beobachten.

Danach die Badeslösung durch Neuromodulatoren wie Serotonin gemäß dem vorherigen Experiment ersetzen und jegliche Änderung der Antwort aufzeichnen. Weitere Übungen sind im begleitenden Text angegeben. Diese Aufnahme zeigt die Aktionspotentiale, die von der dritten Leitung vor und während der Stimulation des Cuticula mit einem Pinsel aufgezeichnet wurden; vergleichen Sie die Frequenz der Aktionspotentiale vor dem Abtasten mit ihrer Frequenz während der Stimulation.

Diese Aufnahme zeigt die Aktionspotentiale, die von der dritten Wurzel in physiologischer Kochsalzlösung und in einer Serotoninlösung aufgezeichnet wurden. Vergleichen Sie die Frequenz der Aktionspotentiale in physiologischer Kochsalzlösung mit ihrer Frequenz in Serotonin, wie gerade gezeigt. Das Bürsten erhöht die Feuerrate gegenüber dem Ausgangswert.

Außerdem wird gezeigt, dass Serotonin die Feuerrate im Vergleich zu physiologischer Kochsalzlösung erhöht. Diese Abbildung zeigt, dass die Kombination von Bürstenreiz und Serotonin zu einer noch stärkeren Zunahme der Feuerrate führt. Der Vergleich der extern beobachteten und theoretisch abgeleiteten Effekte der externen Kaliumkonzentration auf das Ruhe-Membranpotenzial verdeutlicht den Einfluss von Ionen auf das Membranpotenzial.

Wir haben Ihnen außerdem gezeigt, wie man ntic-Antworten an neuromuskulären Verbindungen sowohl phasischer als auch tonischer Muskeln aufzeichnet. Diese Techniken können in forschenden Schülerlaboren eingesetzt werden, um grundlegende Konzepte und physiologische Zusammenhänge zu vermitteln. Die in dieser Laborübung erworbenen Techniken lassen sich nutzen, um Fragen im Zusammenhang mit anderen Laborpräparationen sowie physiologische Anwendungen im Bereich Medizin und Gesundheit zu beantworten.