Physiologische Experimente mit den Crayfish Enddarm: Ein Schülerlabor Übung

Das übergeordnete Ziel dieses Berichts ist es, ein Lehrmittel für fortgeschrittene Schüler in höheren Klassenstufen und für Studierende in Physiologiekursen zu sein, die an physiologischen Experimenten teilnehmen. Die Schüler lernen, Kontraktionen im Hinterdarm von Krebsen freizulegen und aufzuzeichnen. Ein weiterer Schritt besteht darin, den Hinterdarm aus dem Tier zu entnehmen, was die direkte Applikation von Substanzen ermöglicht.

Anschließend werden die Kraft und der Rhythmus der Kontraktionen des glatten Darms beobachtet, während verschiedene pharmakologische Wirkstoffe appliziert werden, um die Mechanismen zu untersuchen, die die Kontraktionsstärke verändern. Es werden Ergebnisse erhalten, die anhand pharmakologischer Assays und Rezeptorsubtypisierung die Wirkung von Modulatoren entweder auf die neuronale Innervation oder direkt auf den Muskel zeigen. Hallo, ich bin Dr. J. Mercier vom Department für Biologische Wissenschaften der Brock University.

Ich verwende den Hinterdarm der Krebse als Präparation, um Forschung über Neurotransmitter durchzuführen, die viszerale Muskeln steuern. Ich setze diese Präparation außerdem als Lehrmittel ein, und im Rahmen einer Zusammenarbeit mit dem Labor von Dr. Robin Cooper an der University of Kentucky entwickeln wir eine Reihe von von Studierenden durchgeführten Experimenten für den Unterricht. Diese Methode kann Einblicke in die Funktion des Hinterdarms der Krebse liefern.

Es kann auch in Studien zu Erkrankungen angewendet werden, die peristaltische Rhythmen betreffen, sowie dazu genutzt werden, die Mechanismen zu beschreiben, die der Modulation von Muskel- und nervöser Innervation zugrunde liegen. Die Studierenden lernen, physiologische und pharmakologische Daten mithilfe von pharmakologischen Substanzen, Neurotransmittern und Neurohormonen zu interpretieren, und erwerben ein allgemeines Verständnis der Rezeptorfunktion.

Was Agonisten und Antagonisten betrifft, so werden die Studierenden Dosis-Wirkungs-Kurven erstellen und die Daten grafisch zur statistischen Analyse darstellen. Um das Tier zu betäuben, setzen Sie einen Krebs mit einer Körperlänge von sechs bis zehn Zentimetern für fünf bis zehn Minuten auf Eis. Halten Sie den betäubten Krebs mit einer Hand hinter den Scheren fest. Schneiden Sie schnell von der Augenhöhle bis zur Kopfmitte auf beiden Seiten und trennen Sie anschließend den Kopf des Krebses ab.

Das Blut der Zubereitung wird klebrig sein, wenn es versucht wird, daher waschen Sie die Werkzeuge nach Beendigung gründlich. Schneiden Sie danach die Beine und die Scheren ab. Danach die linken und rechten Schwanzflossen, wobei die mittlere Schwanzflosse entlang der dorsalen Seite des Abdomens bis zum letzten Segment aufgeschnitten wird.

Schneiden Sie dann entlang des letzten Segmentes und die andere Seite hinunter. Entfernen Sie die dorsale Schale. Legen Sie die präparierte Krebsart in die mit Siger ausgelegte Petrischale.

Schwache Krebs-Salzlösung. Zum Abdecken der Präparation verwendete man Operationsstifte, um die Präparation in der Petrischale zu befestigen. Der Hinterdarm ist gewöhnlich von einem Geflecht aus Blutgefäßen und Bindegewebe umgeben.

Entfernen Sie diese mit einer Pinzette, wobei darauf zu achten ist, den Darm nicht zu beschädigen. Der Hinterdarm ist nun entlang des Abdomens sichtbar.

Lassen Sie das präparierte Krebsexemplar etwa 10 Minuten in der Salzlösung ruhen, damit es sich vom Schock der Präparation und der Exposition gegenüber der Salzlösung erholen kann. Achten Sie auf die langsamen peristaltischen Kontraktionen des Hinterdarms. Nun kann die Kontraktionsfrequenz bestimmt werden.

Zählen Sie die Anzahl der Kontraktionen, die innerhalb von 30 Sekunden auftreten, und notieren Sie diese in einem Protokoll. Notieren Sie außerdem die Art der auftretenden Kontraktionen und ob sie peristaltisch oder spastisch sind. Achten Sie auf die Richtung eventueller peristaltischer Wellen.

Zählen Sie die Kontraktionsfrequenz in der Nähe des Anus und in der Bauchmitte und prüfen Sie, ob es Unterschiede zwischen diesen beiden Bereichen gibt. Bereiten Sie verschiedene Testlösungen vor, die die gleiche Temperatur wie das Bad-Salz haben. Die hier zuerst getestete Lösung ist einmikromolare Serotoninlösung, hergestellt in Krebs-Salz.

Entfernen Sie mit einer Pipette die Salzlösung aus dem Hohlraum des freigelegten Abdomens der Krebsartigen und geben Sie die eine Mikromolar-Lösung von Serotonin direkt auf den Hinterdarm. Unmittelbar nach Zugabe der neuen Lösung warten Sie 30 Sekunden und zählen dann 30 Sekunden lang die Kontraktionen im Bereich nahe dem Anus, danach zählen Sie die nächsten 30 Sekunden lang die Kontraktionen in der Mitte des Abdomens. Notieren Sie diese Zahlen in einer Tabelle und vermerken Sie außerdem die Art der auftretenden Kontraktionen. Weiter.

Geben Sie die Testlösung aus der Aufnahmeschale ab und spülen Sie den Hinterdarm mehrmals mit normaler Krebs-Ringer-Lösung aus. Anschließend spülen Sie das Präparat fünf Minuten lang alle 30 Sekunden erneut aus. Danach können Sie die nächste Testlösung hinzufügen, die in dieser Demonstration ein Mikromolar Topamin beträgt.

Notieren Sie Ihre Beobachtungen wie zuvor und wiederholen Sie diesen Vorgang für die restlichen Testsubstanzen. Wenn mehrere Konzentrationen desselben Stoffes verwendet werden, beginnen Sie unbedingt mit der niedrigsten Konzentration und arbeiten Sie sich zu höheren Konzentrationen vor. Die Versuchsanordnung zur Messung der Kraft der GI-Kontraktionen umfasst einen Laptop mit Lab-Chart-7-Software, den Bridge-Pod, das PowerLab, 26 T und den Krafttransducer.

Bevor Sie die Kraft der Kontraktionen der gastrointestinalen Muskulatur messen können, müssen Sie den Magen-Darm-Trakt isolieren. Schneiden Sie hierzu die Muskeln im letzten Bauchsegment weg, stechen Sie zwei oder mehrere Nadeln durch die weiche ventrale Kutikula auf beiden Seiten des Anus und entfernen Sie anschließend den Rest des Abdomens, wobei das Hinterdarm und der Anus an einem kleinen Stück Kutikula befestigt bleiben. Der Darm sollte nahe der Verbindung zwischen Thorax und Abdomen durchtrennt werden.

Verschieben Sie nun den Magen-Darm-Trakt in eine flache Schale mit einem mit Sardinen beschichteten Boden. Entlang der dorsalen Seite des Magen-Darm-Trakts verläuft ein Blutgefäß. Ziehen Sie dieses vorsichtig vom Magen-Darm-Trakt ab.

Geben Sie frische Krebs-Salzlösung auf das Präparat. Bewegen Sie den Krafttransducer über das Präparat. Untersuchen Sie genau den Stift, der an der Unterseite des Krafttransducers befestigt ist.

Das Ende, das am Darm befestigt wird, weist eine kleine Biegung auf. Haken Sie die kleine Biegung der Nadel an das durchtrennte Ende des Hinterdarms. Nachdem der Hinterdarm befestigt ist, bewegen Sie die Petrischale leicht, bis der Hinterdarm straff gespannt ist.

Seien Sie vorsichtig bei diesem Schritt, da der Darm straff, aber nicht zu fest sein sollte. Zu starke Spannung könnte den Muskel beschädigen. Wenn die Petrischale in der optimalen Position ist, verwenden Sie Wachs oder Ton, um die Schale festzuhalten.

Als Nächstes starten Sie die Software. Öffnen Sie die Lab-Chart-Software, um mit der Aufnahme zu beginnen. Schließen Sie die Lab-Chart- und die Welcome-Center-Anwendung.

Wechseln Sie oben links zur Einrichtung. Klicken Sie unten links auf Kanaleinstellungen. Ändern Sie die Kanaleinstellungen, sodass nur ein Kanal vorhanden ist.

Klicken Sie rechts auf dem Bildschirm auf „Okay“. Gehen Sie zum Kanal eins, öffnen Sie die Bridge-Pod. Stellen Sie die Empfindlichkeit auf die empfindlichste Stufe ein, in diesem Fall 200 Mikrovolt, oben in der rechten Ecke des Diagramms.

Stellen Sie die Zyklen pro Sekunde auf 2K ein. Sie können nun mit der Aufnahme beginnen. Klicken Sie auf „Start“, um sicherzustellen, dass die Einrichtung ordnungsgemäß funktioniert.

Berühren Sie die Transducer-Spitze leicht mit einer Pipette. Sie sollten eine Änderung der vom Software erfassten Kraft sehen. Klicken Sie in der Software auf „Stop“, dann auf „Start“ und lassen Sie das Programm laufen.

Klicken Sie etwa 20 Sekunden lang auf „Stop“ und fügen Sie einen Kommentar mit der Bezeichnung Salzlösung hinzu. Berechnen Sie die Kontraktionsrate, indem Sie die Zeit von Beginn einer Ausschlagung bis zum Beginn der nächsten messen oder indem Sie die Gesamtanzahl der Ausschläge über eine oder zwei Minuten zählen. Berechnen Sie die Rate je nach Häufigkeit der Kontraktionen in Kontraktionen pro Minute oder in Kontraktionen pro Sekunde.

Um die Kraft von Kontraktionen zu messen, verwenden Sie eine relative Messgröße, um Kontraktionen unter verschiedenen Bedingungen in der gespeicherten Datei zu vergleichen. Bewegen Sie die Markierung M zur Basislinie, dann verschieben Sie den Cursor zur Spitze der Ausschlagung und notieren Sie den Wert, der oben rechts auf dem Bildschirm angezeigt wird. Dies ist ein Delta-Wert, der die Differenz von M bis zur Spitze angibt.

Beachten Sie, dass der Cursor am Peak stationär gehalten werden muss, um die Änderung messen zu können. Bewegen Sie dann den M-Marker und den Cursor zur nächsten interessierenden Wellenform und wiederholen Sie die Messung, um die Wirkung von Modulatoren zu untersuchen. Wechseln Sie bei dieser Präparation langsam die Salzlösung zu einer Testlösung.

In diesem Fall eine Mikromolar Serotonin zugeben und die Aufzeichnung der Kontraktionsfrequenz und -kraft als letzten Test fortsetzen. Bei dieser Versuchsanordnung testen, ob Hemmstoffe der Nexus-Kontakte die Frequenz oder Kraft der Kontraktionen verändern; zu den Hemmstoffen der Nexus-Kontakte gehören ein Hep-Ethanol oder physiologische Kochsalzlösung, die mit Kohlendioxid durchblubbert wurde. Diese Verbindungen werden zuletzt verwendet, da sie nach längerer Einwirkung die Muskel­fasern schädigen können. Um die Wirkung der verschiedenen Verbindungen zu vergleichen, die Daten in einem Diagramm darstellen.

Eine weitere interessante Anwendung dieser Präparation besteht darin, die von den Ringmuskeln erzeugte Kraft aufzuzeichnen. Wenn Sie jedoch Gap-Junction-Inhibitoren auf Ihre Präparation angewendet haben, könnten die Inhibitoren die Ringmuskeln beschädigt haben; in diesem Fall sollten Sie eine frische Hinterdarmpräparation verwenden, um die Ringmuskeln zu testen. Um die Ringmuskeln freizulegen, schneiden Sie das Darmrohr mit einer feinen Schere in einer Längsebene an.

Verwenden Sie feine Nadeln, um eine Seite sicher an der Schale zu befestigen. Befestigen Sie den Haken der Nadel am Wandler an der anderen Seite des Streifens. Setzen Sie das Präparat denselben Verbindungen aus, die zuvor an den Längsmuskeln getestet wurden; die Beziehung zwischen den getesteten Verbindungen und der Anzahl sowie Art der Kontraktionen ist hier dargestellt.

Sie können die Anzahl der Kontraktionen in Abhängigkeit von der Zeit für die Salzlösung, Serotonin und Glutamat grafisch darstellen. Außerdem können Sie die Anzahl der Kontraktionen in Abhängigkeit von der Kontraktionskraft in Millivolt für die Salzlösung, Serotonin und Glutamat grafisch auftragen. Solche Darstellungen können sowohl für die longitudinale als auch für die zirkuläre Muskulatur durchgeführt werden, um zu prüfen, ob die longitudinale und zirkuläre Muskulatur in verschiedenen Darmabschnitten unterschiedliche Reaktionen auf die jeweiligen Modulatoren zeigt.

Die oben beschriebenen Experimente können an verschiedenen Regionen vom Anus ausgehend entlang des Abdomens durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist darauf zu achten, den Magen-Darm-Trakt mit der Pinzette nicht zu beschädigen und den Kraftsensor nicht zu stark zu belasten. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie elektrophysiologische Ableitungen der Muskulatur durchgeführt werden, um weitere Fragestellungen wie die Funktion und Modulation von Ionenkanälen zu untersuchen, die als Modell auch für andere Gewebe in weiteren Tiermodellen dienen können.