Postsynaptische Recordings am afferenten Dendriten Kontaktaufnahme mit Cochlear inneren Haarzellen: Monitoring multivesikulären Veröffentlichung in einem Ribbon Synapse

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, postsynaptische Aktivität an afferenten Synapsen der inneren Haarzellen zu erfassen. Dies wird erreicht, indem zunächst das sensorische Epithel einer kürzlich von einer entkopften Ratte entnommenen Cochlea freigelegt wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die exzidierte Apex auf eine modifizierte Deckglasunterlage zu positionieren und in die Ableitungskammer zu überführen.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, einen afferenten Fortsatz mit einer Ableitelektrode zu lokalisieren und Zugang dazu zu erhalten. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Bildung einer engen Dichtung auf der afferenten Faser und anschließendes Aufbrechen der Membran, um die Ganzzell-Konfiguration der Patch-Clamp-Technik zu etablieren. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die postsynaptische Ereignisse oder Potentiale von einer einzelnen Ribbon-Synapse mittels Ganzzell-Patch-Clamp-Elektrophysiologie zeigen.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Dissektion und Vorbereitung des Cochleagewebes schwer zu erlernen ist und die kleinen afferenten Fasern schwer zu erkennen und zu erreichen sind. Vor Beginn der Dissektion bereiten Sie eine modifizierte Deckglasabdeckung vor, die die Probe während der Ableitungen an Ort und Stelle hält. Verwenden Sie dazu ein kreisförmiges Glas-Deckglas mit einem Durchmesser von acht bis zwölf Millimetern und geben Sie einen Tropfen halbgehärteten Sylgard an den Rand des Deckglases.

Platzieren Sie das dicke Ende einer feinen Insektennadel auf dem Deckglas. Halten Sie die Insektennadel fest gegen das Glas. Erhitzen Sie mit einer Pinzette die Dichtleiste an einer beheizten Spule, um sie zu fixieren.

Bereiten Sie 10 bis 20 Mikroelektroden wie im begleitenden Text beschrieben vor. Nach dem Glühen mit einer Mikroschmiede sollte die Mikroelektrode einen äußeren Spitzen­durchmesser von etwa einem Mikrometer aufweisen. Die endgültige Wanddicke der Pipette beträgt etwa ein Drittel eines Mikrometers, nachdem ein drei Wochen altes Ratten­tier anästhesiert und enthauptet wurde.

Beginnen Sie die Dissektion, indem Sie die Haut entfernen, den Kopf dissezieren und das Gehirn entfernen. Um das Paukenbein freizulegen, entfernen Sie beide Paukenbeine. Legen Sie jedes Paukenbein in eine saubere Dissektionschale, die eine standardmäßige extrazelluläre Lösung enthält. Als nächster Schritt wird das die Paukenbeine umgebende Knochengewebe entfernt, um die Cochlea freizulegen.

Halten Sie das Felsenbein mit einer Pinzette sicher an der Basis fest. Identifizieren Sie das runde und ovale Fenster sowie die Cochlea. Richten Sie die Cochlea so aus, dass das ovale Fenster und die spiralförmige Seite der Cochlea nach oben zeigen.

Entfernen Sie überschüssigen Knochen um die Cochlea herum. Verwenden Sie ein zweites Paar feiner Pinzetten, um den Knochen direkt von der Cochlea abzuknipsen, beginnend mit dem Bereich, der durchsichtiger ist als der Rest des Knochens. Hier ist der Knochen dünner und leichter zu entfernen.

Setzen Sie das Entfernen des Knochens um die apikale Windung fort. Schneiden Sie mit einer mikrochirurgischen Schere durch die Membran unterhalb der apikalen Windung. Trennen Sie anschließend die apikale Windung von den unteren Windungen der Cochlea ab.

Achten Sie darauf, die apikale Spirale zu schützen. Sie sollte nicht gezogen oder gedehnt werden. Entfernen Sie schließlich die apikale Windung aus der Cochlea, ohne das Gewebe allzu sehr zu beschädigen.

Verwenden Sie feine Pinzette, um den Rest des Knochens zu entfernen. Der nächste Schritt ist die Entfernung des STR von Oculis und der tial-Membran. Entfernen Sie vorsichtig den STR von Oculis, den glänzenden Gewebestreifen, der außerhalb des Haarzellenbereichs liegt.

Stellen Sie sicher, dass Sie die Sinneshaarsinneszellen nicht entfernen, da diese leicht zusammen mit dem STR von oculis abgelöst werden können. Verwenden Sie danach feine Pinzetten, um die tiale Membran zu lösen. Die glänzende, halbdurchsichtige Membran, die über den Sinneshaarsinneszellen liegt, wird nun durch Abschneiden überschüssigen Gewebes und Knochens sowie Glätten der Präparation mit der Pinzette präpariert.

Dies ist notwendig, damit das Gewebe gleichmäßig unter einer Nadel platziert werden kann. Die Präparation ist nun abgeschlossen. Legen Sie das Präparat unter der Nadel auf die vorbereitete Deckglasabdeckung, wobei darauf zu achten ist, die Nadel nach Beendigung der Präparation von den Haarzellen weg zu positionieren.

Verwenden Sie eine Pinzette, um die Probe in die Ableitungskammer zu überführen, wobei ein Tropfen extrazellulärer Flüssigkeit auf dem Deckglas verbleiben muss, das das Cochleagewebe hält; beginnen Sie unmittelbar mit der Perfusion mit extrazellulärer Lösung. Um ein besseres Überleben der Probe sicherzustellen, verwenden Sie das 10×-Objektiv oder das 40×-Wasserimmersions-DIC-Objektiv des Mikroskops. Um die Probe zu positionieren, richten Sie sie so aus, dass die Ableitelektroden die inneren Haarzellen im rechten Winkel zu deren lateralen Wänden erreichen können.

Wenn die Sichtbarkeit des basalen Bereichs der inneren Haarzellen eingeschränkt ist, weil die Präparation nach oben gewölbt ist, verwenden Sie eine Aufnahmeelektrode, um den äußeren Rand der Präparation vorsichtig gegen die Glasdeckenscheibe zu drücken, wobei Sie darauf achten, die inneren Haarzellen selbst nicht zu belasten. In dieser Präparation hält die obere Elektrode den äußeren Rand der Präparation fest, während die untere Elektrode die Position der afferenten Batons markiert.

Zur Referenz zeigt die NC 70 Nuv Con Kamera das vergrößerte Forex-Bild auf dem Monitor an, um zu beurteilen, ob das Gewebe im Bereich der inneren Haarzellen gesund ist. Suchen Sie die Haarbüschel als Referenzpunkt und fokussieren Sie nach unten, um die Kerne zu finden. Fokussieren Sie weiter nach unten in Richtung der Basis der inneren Haarzellen mit ihren afferenten Endigungen und anschließend wieder nach oben, bis die Ebene der Kerne auf dem Monitor erreicht ist.

Suchen Sie nun die afferenten Batons um die Basis der inneren Haarzellen. Batons sind kugelförmig oder ellipsoid, haben einen Durchmesser von etwa einem Mikrometer und sind hell gefärbt mit einem glänzenden Aussehen. Sie finden sie, indem Sie die Fokusebene nach oben und unten verändern.

Der nächste Schritt besteht darin, mit einer Aufnahmeelektrode mit einer einmikronigen Spitze, die mit intrazellulärer Lösung gefüllt ist, einen Weg zu den afferenten Fasern freizulegen. Positiven Druck anlegen und den Mikromanipulator verwenden, um die Elektrode zur Präparation zu bewegen. Mit dieser Elektrode einen Schnitt in der Präparation auf Höhe der Basis der inneren Haarzellen durchführen.

Schieben Sie die Elektrode unter Verwendung von positivem Druck zwischen die dünne Schicht der Stützzellen und die innere Haarzellen, um einen Zugangsweg zum Bereich an der Basis der inneren Haarzellen zu schaffen. Entfernen Sie die Elektrode vorsichtig und ersetzen Sie sie durch eine frische Elektrode mit einer Spitze von einem Mikrometer Durchmesser, die mit intrazellulärer Lösung gefüllt ist. Unter Verwendung von positivem Druck, um eine saubere Elektrodenspitze zu gewährleisten, bewegen Sie die Ableitelektrode durch das Zugangsloch an benachbarten Stützzellen vorbei in Richtung des afferenten Batons.

Stellen Sie sicher, dass sich die Elektrodenspitze direkt vor dem afferenten Baton befindet. Batons weisen einen höheren Widerstand gegenüber der Bewegung der Pipette auf als die Stützzellen und die Membran der inneren Haarzelle. Dieser Unterschied ist spürbar, während die Pipette bewegt wird. Bewegen Sie die Pipette auf und ab und drücken Sie leicht, um sicherzustellen, dass sich der Baton bewegt. Dies zeigt an, dass sich die Pipettenspitze und der Baton in derselben Fokusebene befinden und die Elektrode gegen den afferenten Baton gedrückt ist. Gleichzeitig positiven Druck abbauen und Saugkraft anwenden, um einen Gigaohm-Siegel zu bilden.

Wenden Sie sanfte Saugstöße an, um die Membran innerhalb der Elektrode zu rupturieren und eine Ganzzell-Aufzeichnung zu erhalten. Wenn die gepatchte Zelle ein afferentes Baton ist, werden in der Ganzzell-Aufzeichnungsmodus kleine kapazitive Transienten beobachtet. Diese Abbildung zeigt eine typische Transiente, die von einer afferenten Faser aufgezeichnet wurde.

Beginnen Sie mit der Aufzeichnung der synaptischen Aktivität. Wenn die afferente Faser keine spontane Aktivität zeigt, depolarisieren Sie die Haarzelle, indem Sie eine extrazelluläre Lösung mit einer höheren Kaliumkonzentration applizieren. Diese Abbildung zeigt typische Strom-Spannungs-Beziehungen für AFF-Fasern auf der linken Seite und für innere Haarzellen auf der rechten Seite.

Die Strom-Spannungs-Beziehungen wurden bei einem Haltepotential von minus 84 Millivolt mit Spannungsschritten von minus 124 Millivolt bis plus 36 Millivolt in 10-Millivolt-Inkrements aufgezeichnet. Die Spannungen sind rechts einiger Spuren dargestellt, die sich auf die Strom-Spannungs-Beziehungen einer afferenten Faser konzentrieren. Beachten Sie, dass die exzitatorischen postsynaptischen Ströme oder EPCs während der Mehrheit der Spannungsschritte vorhanden sind.

Die EPCs kehrten ein positives Potential bei etwa positiven sechs Millivolt um. Diese Aufnahme wurde in Gegenwart von Tetra- to- Toxin durchgeführt, um spannungsabhängige Natriumströme zu blockieren; ohne den Blocker wären zusätzlich schnell aktivierende, nach innen gerichtete Natriumströme in der Aufnahme erschienen und hätten die Aufnahme als Aufnahme einer afferenten Faser identifiziert. Beachten Sie den langsam aktivierenden, nach innen gerichteten Strom bei hyperpolarisierenden Spannungen.

Dieser Strom ist in inneren Haarzellen oder Stützzellen nicht vorhanden und liefert einen guten Hinweis darauf, dass die Ableitung von einer afferenten Faser stammt. Diese Ableitungen zeigen die Strom-Spannungs-Beziehungen einer inneren Haarzelle. Der Pfeil zeigt auf die schnell aktivierenden nach außen gerichteten Kaliumströme bei positiven Potentialen.

Diesen folgen verzögerte rectifier-Kaliumströme aufgrund eines engen Pipettendurchmessers und eines hohen Zugangswiderstands. Die hier gezeigten Ströme der inneren Haarzellen sind kleiner als erwartet, um genaue Ableitungen der Ströme der inneren Haarzellen zu erhalten. Pipetten mit niedrigeren Zugangswiderständen sollten verwendet werden.

Die hier gezeigten Aufnahmen zeigen jedoch, dass die Strom-Spannungs-Beziehungen von Innenhaarsinneszellen und afferenten Fasern eindeutig unterschieden werden können. Diese Abbildung zeigt synaptische Ströme, die von einer afferenten Faser aufgezeichnet wurden. Beachten Sie die variable Größe und Form der EPCs.

Die Aufnahmen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt, wobei Tetrahydrochinolin (tetra toin) zugegeben wurde, um die spannungsabhängigen Natriumströme zu blockieren. Diese Abbildung zeigt simultane Aufnahmen von einer Innenhaarzelle und einem kontaktierenden afferenten Zapfen. Ein Spannungsschritt wurde verwendet, um die Innenhaarzelle zu depolarisieren, und als Antwort darauf wurden nach innen gerichtete Kalziumströme von der Innenhaarzelle registriert. Der Kalziumeinstrom führt zur Neurotransmitterfreisetzung und aktiviert EPSCs (excitatory postsynaptic currents) im afferenten Zapfen.

Beachten Sie, dass während einer 50 Millisekunden dauernden Depolarisation der inneren Haarzelle eine synaptische Depression auftritt. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, beim Dissektieren und Vorbereiten des cochleären Gewebes sorgfältig vorzugehen und geduldig und optimistisch zu bleiben, wenn versucht wird, von afferenten Endigungen abzuleiten.