Ein High-Throughput-Screen für Biomining Cellulase Aktivität von Metagenombanken

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Klone mit Zellulase-Expression aus einer metagenomischen Bibliothek zu identifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst mithilfe eines Roboters eine zuvor erstellte metagenomische Bibliothek repliziert und die replizierte Bibliothek anschließend 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubiert wird. Das Wachstum der E. coli-Klone wird gemessen, danach werden Lysispuffer und Substrat zur replizierten Bibliothek hinzugefügt.

Schließlich können Ergebnisse erhalten werden, die Cellulase-Aktivität durch farbmetrische Absorptionsmessungen unter Verwendung eines Plattenlesegeräts zeigen. Hallo, ich bin Keith aus dem Labor von Steven Hallam am Department für Mikrobiologie und Immunologie der University of British Columbia. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur hochdurchsatzfähigen funktionellen Bildschirmuntersuchung von Metagenom-Bibliotheken.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Biomin-Cellulase-Aktivität aus metagenomischen Bibliotheken zu untersuchen. Beginnen wir also. Bevor Sie mit diesem Protokoll beginnen, bereiten Sie eine metagenomische Bibliothek vor, die in einem 384-Well-Plattenformat gelagert ist.

Diese Studie verwendete den PCC-Einkopien-Kontroll-SMID-Vektor in Kombination mit Farge T1-resistenten TRANSFECT max EPI 300 T1-resistenten E. coli-Zellen als Bibliotheks-Wirt, um dieses Verfahren zu beginnen. Entnehmen Sie die Platten mit der Bibliothek aus der Lagerung bei minus 80 Grad Celsius und tauen Sie sie etwa 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius auf. In der Zwischenzeit nutzen Sie die UV-Licht-Sterilisierungsfunktion des QIX2, um den Roboter 15 Minuten lang zu sterilisieren. Richten Sie den Q fill 3 gemäß den Herstelleranweisungen ein, wobei die Mediumsflasche über sterile Schläuche an das Verteilerrohr angeschlossen wird.

Füllen Sie mit dem Q fill three die entsprechende Menge Medium und stellen Sie es so ein, dass ein Volumen von 45 Mikrolitern gefüllt wird. Entfernen Sie in jedem Kanal die Luft aus Schläuchen und Verteiler mit der Spülfunktion des Roboters, bis Medium sichtbar ist. Füllen Sie mit dem Q fill three über jeden Pin des Verteilers die gewünschte Anzahl von Platten mit LB-Medium.

Jede Platte benötigt etwa 20 Sekunden zum Befüllen. Danach die Bibliotheksplatten und die neuen Platten in die entsprechenden Bereiche der Q-Picks einlegen. Den Roboter anweisen, die Reinigungsbäder mit den entsprechenden Reagenzien zu befüllen.

2 % Micro 90 im hinteren Bad, destilliertes Wasser im mittleren Bad autoklavieren und 80 % Ethanol im vorderen Bad. Mithilfe des Replikationsprogramms des Qix Two den geeigneten Kopf sowie die Anzahl und Typen der Quell- und Zielplatten auswählen. Außerdem den Kopf so einrichten, dass er zwischen den Replikationen gereinigt wird.

Gewöhnlich sind sechs Zyklen in jedem Bad ausreichend. Die Kapazität der Maschine beträgt 10 Platten gleichzeitig. Stellen Sie die Maschine so ein, dass sie läuft.

Die Replikation dauert ungefähr 15 Minuten. Volle Kapazität mit einem 384-Pin-Kopf. Nachdem die Platten repliziert wurden, inkubieren Sie die Platten 24 Stunden bei 37 Grad Celsius in einer Feuchtigkeitskammer.

Die lange Inkubationszeit ist notwendig, da durch die Zugabe von Arabinose eine hohe Kopienzahl von smid induziert wird. In der Zwischenzeit reinigen Sie den Q Fill Three-Roboter gemäß dem schriftlichen Protokoll. Entfernen Sie nach der Inkubation die Platten aus dem 37 Grad Celsius-Brutschrank.

Stellen Sie die Deckel beiseite und legen Sie die Platten auf die mit dem Rapid Stack bereitgestellte Magazinladeplattform. Achten Sie darauf, die Reihenfolge der Platten im Auge zu behalten, da die Software dies nicht tut. Die Platten am unteren Ende des Stapels werden ausgelesen.

Entfernen Sie zuerst ein Magazin aus dem Schnellstapel. Stellen Sie sicher, dass es leer ist, und schieben Sie es auf den Stapel der zu lesenden Platten. Greifen Sie das Magazin am Griff und die Platte sollte in das Magazin geladen werden.

Laden Sie das Magazin korrekt ausgerichtet in den schnellen Stapel ein. Öffnen Sie das Scan-Its-Re-Programm auf dem verbundenen Computer. Wählen Sie eine neue Sitzung aus und benennen Sie sie entsprechend.

Wählen Sie eine flache 384er-Platte als Platte aus. Geben Sie den Plattenlayoutbereich ein. Wählen Sie die Assistentenschaltfläche und wählen Sie die Option, um 384 unbekannte Proben zur Platte hinzuzufügen.

Wählen Sie im Protokollbereich die Option „Wellenschleife“ und geben Sie 384 Vertiefungen ein. Ein Symbol für die Vertiefungsschleife erscheint im Ablaufbaum auf der linken Seite des Bildschirms. Wählen Sie das Symbol aus und klicken Sie, um eine photometrische Messung hinzuzufügen.

Stellen Sie es so ein, dass bei 600 Nanometern gelesen wird. Speichern Sie das Protokoll unter einem eindeutigen Namen und schließen Sie das Scan-its-Programm. Öffnen Sie dann das Polara-RS-Programm.

Auf der Hauptseite befindet sich eine Tabelle, die die unter der Überschrift VARI scan mit dem Rapid-Stack-Gerät verbundenen Instrumente auflistet. Klicken Sie auf die Option „Run Session“. Daraufhin sollte das Assay-Fenster mit einem Flussdiagramm in der Mitte erscheinen. Wählen Sie den Eintrag „Run Session“ aus und suchen Sie dann den Namen des gespeicherten Scans.

Wählen Sie im Dropdown-Menü, das auf der rechten Seite des Bildschirms erscheint, erneut „Run“ aus. Sobald das Protokoll ausgewählt wurde, klicken Sie auf „Run“. Bei diesem Assay erscheint ein Fenster, in dem gefragt wird, welches Magazin als Quelle verwendet werden soll und welches Magazin leer ist.

Das untere Feld auf dem Bildschirm entspricht dem vorderen Magazin-Zine. Stellen Sie sicher, dass sowohl der Rapid-Stack als auch der Vario-Scan eingeschaltet sind, und klicken Sie auf Start. Der Rapid-Stack lädt automatisch die Platten in das Plattenlesegerät, wodurch kontinuierliche Messungen der Platten ermöglicht werden.

Beobachten Sie das Einladen der ersten Platte in den Vario-Scanner, um sicherzustellen, dass die Geräte korrekt ausgerichtet sind, um zu lesen. Das Scannen von 25 Platten dauert etwa 50 Minuten. Sobald der Barrios-Scan abgeschlossen ist, entfernen Sie das volle Magazin und stellen es auf die Magazinladeplattform.

Heben Sie das äußere Rechteck der Plattform an, und das Magazin sollte herausgleiten, wobei die Platten in einem Stapel in der Mitte stehen bleiben. Schließlich setzen Sie die Deckel auf die Platten auf, um einen lösungsbasierten Screen durchzuführen. Für die Zellulaseaktivität bereiten Sie zunächst das Assaygemisch unter Verwendung einer vorgefertigten 10-fach-Stammlösung der Lyse vor.

Vermischen Sie 50 Millimolar Kaliumacetat-Puffer bei pH 5,5, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Bereiten Sie anschließend einen Vorrat von bis zu 75 Milligramm pro Milliliter chromogenem DIPHENYL- oder DNP-Zellbiocid-Substrat in DMSO vor, wobei sichergestellt werden muss, dass das Substrat vollständig gelöst ist. Geben Sie die DNP-Zellbiocid-Stammlösung zur Assay-Mischung hinzu, um eine Endkonzentration von 0,1 Milligramm pro Milliliter zu erreichen.

Beachten Sie, dass jede Platte etwa 20 Milliliter Lösung verbraucht und zusätzlich 50 Milliliter erforderlich sind, um das Totvolumen auszugleichen. Richten Sie den Q fill three wie zuvor am Assay-Mix für jede Platte mit dem Q fill three ein. Das Befüllen jeder Platte dauert ungefähr 20 Sekunden.

Nachdem das Assay-Gemisch hinzugefügt wurde, inkubieren Sie die Platten 12 bis 16 Stunden bei 37 Grad Celsius. Entnehmen Sie die Platten im Feuchtigkeitsbehälter aus dem 37-Grad-Celsius-Inkubator. Stellen Sie die Deckel beiseite und setzen Sie die Platten genauso wie zuvor auf die mit dem Rapid Stack bereitgestellte Ladeplattform für das Magazin.

Öffnen Sie das Scan-its-Re-Programm, und richten Sie es wie zuvor eingerichtet haben, mit der Ausnahme der photometrischen Messung, die auf 400 Nanometer eingestellt werden sollte. Geben Sie anschließend die Parameter in das POLARA RS-Programm ein. Wie zuvor gezeigt.

Lassen Sie den Vario-Scan die Platten auslesen. Entfernen und entsorgen Sie nach dem Durchlauf die Platten. Um die Absorptionswerte zu exportieren, öffnen Sie die Scan-Software, und wählen Sie aus.

Öffnen Sie eine vorhandene Datei. Wählen Sie das Verzeichnis aus, in dem die Sitzung gespeichert wurde, und klicken Sie auf das Plus-Symbol, um die Liste zu erweitern. Unter der Titelüberschrift finden sich Optionen, die als Behälter eins bis Behälter N beschriftet sind. Abhängig von der Anzahl der Platten wählen Sie im Menü oben auf der Seite die erste zu analysierende Platte aus und anschließend Datenbericht-Export.

Wählen Sie Optionen für den Export wie Plattenlayout und photometrische Daten. Klicken Sie auf Bericht anzeigen und dann auf Datei speichern. Wählen Sie das gewünschte Verzeichnis.

Das Ausgabeformat ist eine Microsoft Excel-Tabelle. Hier zeigen Absorptionsmessungen aus einer einzelnen 384-Well-Platte, die einen positiven Klon enthält, wie positive Klone einen deutlichen Anstieg der Absorption im Vergleich zu Klone zeigen, die keine Cellulase-Aktivität exprimieren.

Unterschiede in der Assaydauer, der Vertiefung, der Position auf der Platte oder der DNP-Konzentration können die absoluten Absorptionswerte beeinflussen. Relative Absorptionswerte, wie beispielsweise die Differenz der Absorption gegenüber dem Durchschnittswert der Platte oder der Spalte, stellen eine robustere Methode zur Identifizierung cellulasepositiver Klone dar. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie cellulasepositive Klone aus einer metagenomischen Bibliothek identifiziert werden können.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, Ihre DNP-Zellbio-Seite in DMSO aufzulösen und Ihre Platten in einer Feuchtkammer zu inkubieren. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.