High-Throughput-Assay Verzuckerung für Lignocellulose-Materialien

Hallo, ich bin Kara Ted, ich bin Leo. Geh, ich. Und ich bin Simon McQueen Mason.

Die Verdaulichkeit von Pflanzenbiomasse ist gegenwärtig ein Thema von großem Interesse. Der Grund hierfür liegt darin, dass in den Polysacchariden der Pflanzenzellwände, aus denen diese Biomasse besteht, eine große Menge an Zuckern gebunden ist. Wenn es gelingt, diese Zuckern in einer nutzbaren Form freizusetzen, können sie zur Herstellung verschiedenster Produkte wie Brennstoffe und Chemikalien fermentiert werden. Leider sind diese Materialien äußerst schwer verdaulich, weshalb ein besseres Verständnis der Faktoren, die diese Verdaulichkeit steuern, von erheblicher Dringlichkeit ist.

Um pflanzliches Material für die Herstellung erneuerbarer Rohstoffe nutzen zu können, müssen wir das Vergärungspotential dieser Pflanzen messen können. Hier an der University of York untersuchen wir große Populationen pflanzlichen Materials, um deren Vergärungspotential zu bestimmen. Die Vergärung ist der Prozess, bei dem komplexe Kohlenhydrate in ihre Monosaccharid-Bausteine zerlegt werden, um mithilfe verschiedener industrieller Verfahren wertvolle Chemikalien herzustellen.

Um das Vergärungspotential zu messen, reproduzieren wir industrielle Prozesse auf mikroskaliger Ebene, bei denen Biomasse einer Vorbehandlung und enzymatischen Hydrolyse unterzogen wird, um die freigesetzten Zucker zu bestimmen. Dies ermöglicht die Identifizierung interessanter Genotyp-Varianten. Das Hochdurchsatzsystem arbeitet im Format einer IG-Sechskammer-Platte.

Es werden milde Hydrolysebedingungen verwendet, um subtile Unterschiede zwischen Genotypen aufzuzeigen, und die Methode ist zudem flexibel genug, um verschiedene Substratmaterialien zu verwenden sowie unterschiedliche Enzyme zu evaluieren. Die von uns verwendete Methode beinhaltet die Aufbereitung des Pflanzenmaterials zu einem Pulver, das anschließend 20 Minuten lang mit einer verdünnten Säure oder Base bei 90 Grad vorbehandelt wird. Danach erfolgt eine enzymatische Verdauung mithilfe einer kommerziellen Cellulasemischung bei 50 Grad über einen Zeitraum von acht Stunden.

Schließlich wird eine MBTH-Methode zur Bestimmung der Freisetzung von reduzierenden Zuckern verwendet. Das Pflanzenmaterial wird als trockene Stängel geerntet, die in vier Millimeter lange Segmente geschnitten werden. Diese werden zusammen mit drei metallischen Kugeln mit einem Durchmesser von fünf Millimetern in 2-Milliliter-Fläschchen gegeben.

Die Gefäße sind einzeln mit Barcodes gekennzeichnet, die gescannt werden, um die Rückverfolgbarkeit der Proben sicherzustellen. Die Proben werden in die Mahl- und Formatierungsroboter eingelegt. Die Proben werden automatisch gemahlen und gemischt, um die Abgabe der Biomasse in eine 96-Loch-Platte zu ermöglichen.

Die Fläschchen werden durchstochen, dann wird das Fläschchen im Roboterarm so neu positioniert, dass es sich innerhalb eines Trichters befindet, der vibriert, um das Pulver abzugeben. Die Vibration des Trichters wird über eine Waage geregelt, um die Zielmenge an Masse pro Vertiefung zu erreichen, die abgegeben wird. Die Biomasse wird in 10 Spalten der Platten abgegeben, wobei zwei Spalten für Standards freigelassen werden.

Indem wir vier Wiederholungen pro Probe durchführen, laden wir 20 Proben pro Platte auf. Der Hydrolysat dieser Platte wird dreifach auf PCR-Platten aufgeteilt, was zu drei optischen Platten führt. Auf diese Weise erhalten wir drei Bestimmungen von reduzierenden Zuckern pro Probe der Biomasse.

Nach der Formatierung werden die Platten mit einer Silikonmatte versiegelt, um Verdunstung zu vermeiden. Sobald sie bereit sind, werden sie zum Flüssigkeits-Handling-Roboter gebracht. Bei diesem erfolgen die Vorbehandlung, die enzymatische Hydrolyse und die Bestimmung der freigesetzten Zucker automatisch.

Der zwei Meter lange Tisch verfügt über Behälter für die benötigten verschiedenen Reagenzien sowie über Stauraum für das Plastikzubehör. Es gibt Inkubatoren für die Vorbehandlung und Hydrolyse sowie Thermocycler für die Zuckermessung. Die Vorbehandlung erfolgt in der Deep-Well-Platte.

Durch Zugabe verdünnter Säure- oder Alkalilösungen zum Biomassepulver. Die Platten werden auf den Heizblock überführt und 20 Minuten bei 90 Grad inkubiert. Nach Beendigung dieser Inkubation wird die Vorbehandlung durch fünfmaliges Spülen mit jeweils 500 Mikrolitern Acetatpuffer entfernt.

Nachdem die Vorbehandlung abgespült wurde, wird ein Enzymcocktail hinzugefügt. Es handelt sich um eine Standardmischung, die Cellulase und Novozym 188 im Verhältnis vier zu eins in einer Konzentration von sieben FPU pro Well enthält.

Die Platten werden acht Stunden bei 50 Grad unter Schütteln inkubiert. 75 Mikroliter des resultierenden Hydrolysats werden in eine PCR-Platte überführt. In den Spalten 11 und 12 der PCR-Platten werden die Glucose-Standards hinzugefügt.

Anschließend werden 25 Mikroliter einer einmolarigen Natriumhydroxidlösung zu allen Vertiefungen hinzugefügt. Schließlich werden 50 Mikroliter MBTH-Reagenz in die PCR-Platte pipettiert. Die Deep-Well-Platte wird aufbewahrt, nachdem der Hydrolysat-Transfer auf die dritte PCR-Platte abgeschlossen ist.

Während die PCR-Platten zur Inkubation bei 60 Grad für 15 Minuten in die Thermocycler verbracht werden. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Übertragung des Reaktionsgemischs in optische Platten zur Farbentwicklung. Nach der Inkubation werden die PCR-Platten aus dem Thermocycler entnommen.

Ein hundert Mikroliter Oxidationsreagenz werden der übertragenen Reaktionsmischung zugegeben. Zur Förderung der Farbentwicklung wird der Flüssighandhabungsprozess innerhalb von 24 Stunden viermal durchgeführt, wobei die Vorbehandlungsreinigung und die Zugabe des Enzyms etwa zwei Stunden in Anspruch nehmen. Die Enzymhydrolyse dauert acht Stunden, und die Zuckerbestimmung benötigt weitere zwei Stunden.

Während die erste Platte acht Stunden lang inkubiert wird, beginnt die nächste Platte den Prozess. Mit dieser Zuteilung der Roboterrressourcen werden drei Durchläufe mit jeweils 80 Proben pro Tag erreicht, um die Menge an freigesetzten reduzierenden Zuckern zu bestimmen. Die optischen Platten werden bei 620 Nanometern gemessen.

Die erhaltenen Ergebnisse werden analysiert, um die freigesetzten Zucker als Nanomol pro Milligramm pro Stunde der Reaktion zu quantifizieren. Vielen Dank fürs Zuschauen, und ich hoffe, dies regt Ihre Forschung im Bereich Biokraftstoffe an.