Mit einem Pan-Viral Microarray-Assay (Virochip) zur klinischen Proben, die für virale Erreger Bildschirm

Dieses Verfahren verwendet den Viro-Chip, einen panviralen Microarray-Assay, um klinische Proben auf bekannte und unbekannte Viren zu analysieren. Zunächst werden Nukleinsäuren aus klinischen Proben extrahiert. Anschließend wird die extrahierte RNA mit Hilfe von zufälligen Primern revers transkribiert.

Die Synthese des zweiten DNA-Strangs wird durchgeführt und die DNA-Bibliothek mittels zufälliger PCR amplifiziert. Anschließend wird die amplifizierte DNA mit fluoreszenten Farbstoffen markiert und auf einem viralen Chip-Microarray hybridisiert. Der letzte Schritt besteht in der Scannung und Analyse des Microarrays.

Schließlich können Ergebnisse erzielt werden, die anhand der Analyse des Chip-Microarrays das Vorhandensein oder Fehlen eines Virus oder mehrerer Viren zeigen. Breitband-Detektionsmethoden wie ein virales Chip-Microarray werden in der diagnostischen Mikrobiologie benötigt, da häufige klinische Syndrome wie Pneumonie nicht auf einen einzelnen Erreger beschränkt sind und aufgrund der ständigen Bedrohung durch neu auftretende virale Pathogene wie das SARS-Coronavirus und das neuartige Influenzavirus H1N1 aus dem Jahr 2009. Diese Methode kann zentrale Fragen im Bereich der diagnostischen Mikrobiologie beantworten, beispielsweise welcher Anteil undiagnostizierter Infektionen im klinischen Umfeld möglicherweise durch bislang unbekannte, neuartige Viren verursacht wird. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis hin zu einer besseren Diagnose akuter Erkrankungen im Krankenhaus, da wir gleichzeitig auf Hunderte bis Tausende potenzieller Krankheitserreger testen.

Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmals im Jahr 2002, als wir beschlossen, die neu entwickelte Technologie der Mikroarrays – eine Technik, die im Labor von Dr. Joseph DeRisi an der UCSF maßgeblich vorangetrieben wurde – für den Nachweis von Viren einzusetzen. Unser erster praktischer Anwendungsfall war der Einsatz des Virus-Chips zur Identifizierung eines neuartigen Coronavirus, das 2003 für das SARS verantwortlich war. Die vollständige Durchführung des Verfahrens wird hier von einer Technikerin aus meinem Labor demonstriert, die den Virus-Chip-Test an einem Nasenabstrich einer Kindes durchführt, um die Ursache ihrer akuten Atemwegserkrankung zu diagnostizieren. Nasopharyngeale Abstrichproben werden in sterilen Behältern mit Virus-Transportmedium, einer flüssigen Nährlösung, gesammelt und anschließend bei minus 80 Grad Celsius eingefroren gelagert.

Im Biosicherheitswerkbank lassen Sie das Röhrchen mit der Probe auftauen und rühren Sie den Abstrich kurz in das Medium ein, bevor Sie den Abstrich in einen Behälter für biohazardöses Abfallmaterial entsorgen. Anschließend portionieren Sie 200 Mikroliter der Probe in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Führen Sie die Probe durch einen 0,22-Mikron-Spinfilter, um virale Partikel zu reinigen, und sammeln Sie sie in einem neuen 1,5-Milliliter-Röhrchen auf.

Verwenden Sie anschließend das Turbo DNA-Kit von Ambien gemäß den Herstelleranweisungen, um die genomische Wirtsdna ab abzubauen und die geschützte, verkapselte virale Nukleinsäure zu reinigen. Führen Sie danach eine RNA-Extraktion mit dem XMO ZR-Virus-RNA-Extraktionskit oder dem Qiagen-Ultraschall-Viruskit gemäß den Herstelleranweisungen durch. Bestimmen Sie die Konzentration der extrahierten RNA mithilfe eines NanoDrop-Nukleinsäurespektrophotometers.

Die RNA-Konzentration sollte vorzugsweise mindestens 10 Nanogramm pro Mikroliter betragen, kann jedoch je nach Probe variieren, wobei ein dünwwandiger 200-Mikroliter-Tube verwendet wird. Geben Sie ein Mikroliter Primer A mit einer Konzentration von 40 PICA-Mol pro Mikroliter zu vier Mikrolitern extrahierter RNA hinzu. Erhitzen Sie die Probe fünf Minuten lang auf 65 Grad Celsius in einem Thermocycler und lassen Sie den Tube anschließend fünf Minuten lang auf Raumtemperatur abkühlen.

Fügen Sie anschließend fünf µL einer Master-Mix-Lösung hinzu, die zwei µL 5× RT-Puffer, ein µL 12,5 mmol DNTP, ein µL Wasser, 0,5 µL 0,1 mol DTT und 0,5 µL Superscript III Reverse Transkriptase enthält, in einen Thermocycler. Inkubieren Sie das Gefäß bei 42 °C für 60 Minuten. Erhitzen Sie dann die Probe auf 94 °C für zwei Minuten.

Um die Reverse-Transkriptase-Reaktion abzubrechen, zwei Minuten lang auf 10 Grad Celsius abkühlen und kurz zentrifugieren (fünf Sekunden). Als Nächstes fünf Mikroliter Quease-Mix hinzufügen, bestehend aus einem Mikroliter fünfmal Quease-Puffer, 3,8 Mikrolitern Wasser und 0,15 Mikrolitern Quease für die Synthese des zweiten Strangs. Den Thermocycler innerhalb von acht Minuten von 10 Grad Celsius auf 37 Grad Celsius hochfahren.

8 Minuten bei 37 Grad Celsius halten. Dann auf 94 Grad Celsius für 2 Minuten erhitzen, um die Quease zu inaktivieren, und auf 10 Grad Celsius abkühlen. Falls gewünscht, die Probe mit 15 µL cDNA bei minus 20 Grad Celsius lagern.

Zunächst fünf µL CD-NA-Probe zu 45 µL einer Master-Mix-Lösung hinzufügen, die aus fünf µL 10× PCR-Puffer, einem µL 12,5 mmolar DNTP, einem µL 100 Pico-mol pro µL Primer B, einem µL Cleantech LA und 37 µL Wasser besteht. Anschließend den PCR-Protokollschritt wie folgt durchführen: 94 °C für zwei Minuten, gefolgt von 25 Zyklen mit jeweils 94 °C für 30 Sekunden, 50 °C für 45 Sekunden und 72 °C für eine Minute.

Danach eine abschließende Inkubation bei 72 Grad Celsius für fünf Minuten, gefolgt von einer Lagerung bei 10 Grad Celsius nach der PCR. Überprüfen Sie das PCR-Produkt mittels eines 1,5 %igen Agarose-Elektrophoresegels. Ein Bandenmuster von etwa 200 bis 1000 Basenpaaren sollte sichtbar sein.

Um AAD dNTP einzubauen, geben Sie fünf Mikroliter virales PCR-Produkt zu 45 Mikrolitern einer Master-Mix-Lösung hinzu, die aus fünf Mikrolitern 10× PCR-Puffer, einem Mikroliter 12,5 Millimolar A-A-D-N-T-P, einem Mikroliter 100 pM pro Mikroliter Primer B, einem Mikroliter ClinTech LA und 37 Mikrolitern Wasser besteht. Führen Sie das PCR-Protokoll wie folgt durch: 94 Grad Celsius für zwei Minuten, 15 Zyklen mit 94 Grad Celsius für 30 Sekunden und 50 Grad Celsius für 45 Sekunden.

72 Grad Celsius für eine Minute und ein abschließender Schritt von 72 Grad Celsius für fünf Minuten, anschließend Halten bei 10 Grad Celsius. Reinigen Sie dann das neue PCR-Produkt mit dem DNA Clean- und Concentrator-Kit gemäß den Herstelleranweisungen und lösen Sie es in 10 Mikrolitern Elutionspuffer auf. Geben Sie einen Mikroliter einer einmolarigen Bicarbonatlösung und einen Mikroliter si drei zu den 10 Mikrolitern PCR-Produkt hinzu und inkubieren Sie eine Stunde im Dunkeln.

Als Nächstes reinigen Sie erneut die mit S markierte Probe mit dem DNA Clean and Concentrator Five Kit und eluieren in 12 Mikrolitern Elutionspuffer. Verwenden Sie 1,5 Mikroliter der Probe, um die cDNA-Konzentration und die Menge der eingebauten Farbstoffe auf einem NanoDrop-Spektrophotometer in einer PCR-Streifenkappe zu bestimmen, mit einem Volumen von einem Mikroliter, 25-mal Fragmentierungspuffer, fünf Mikrolitern 5-mal Blockierpuffer, 9,5 Mikrolitern oder der Menge, die für eine normalisierte Endkonzentration von 10 Spitzen- oder Mol pro Mikroliter der mit SI drei markierten Probe erforderlich ist, und Wasser auf ein Gesamtvolumen von 25 Mikrolitern. Geben Sie anschließend 25 Mikroliter zweifachen GX-Hybridisierungspuffers hinzu und zentrifugieren Sie kurz, um Blasen zu entfernen.

Platzieren Sie eine neue Dichtungsfolie in die Hybridisierungskammer. Geben Sie 40 Mikroliter der Probe auf die Dichtungsfolie. Legen Sie danach den mit „Agilent“ markierten bedruckten viralen Array mit der Markierungsseite nach unten auf die Dichtungsfolie und befestigen Sie die Schraube fest.

Platzieren Sie die Hybridisierungskammer in einem Ofen bei 65 Grad Celsius und hybridisieren Sie über Nacht bei einer langsamen Rotation von 10 Umdrehungen pro Minute, um die Arrays zu waschen. Erwärmen Sie zunächst Puffer zwei auf 37 Grad Celsius. Füllen Sie einen 500 Milliliter fassenden Kunststoffbehälter mit etwa 250 Millilitern Puffer.Eins.

Entfernen Sie das Array aus der Hybridisierungskammer, tauchen Sie das Array ein und lösen Sie es von der Dichtungsplatte. Überführen Sie das Array in den sauberen Behälter und waschen Sie es eine Minute lang in Puffer eins. Anschließend mit einem separaten 500 Milliliter fassenden Kunststoffbehälter.

Spülen Sie das Array eine Minute lang in vorgewärmtem Puffer zwei. Nach dem Spülen entfernen Sie das Array langsam aus Puffer zwei, wobei Sie darauf achten müssen, Blasen zu vermeiden.

Verwenden Sie ein Kim-Tuch, um überschüssige Feuchtigkeit abzuziehen, und achten Sie dabei darauf, die aktive Seite des Arrays nicht direkt zu berühren. Legen Sie schließlich den Objektträger mit der Agilent-Seite nach oben in den Objektträgerhalter und setzen Sie ihn in den Array-Scanner ein. In diesem Verfahren verwenden wir einen Agilent Two-Micron-DNA-Microarray-Scanner.

Scannen Sie das SI-drei-markierte Array mit fünf Mikrometern oder zwei Mikrometern gemäß dem standardmäßigen Abtastprotokoll des Instruments. Analysieren Sie virale Chipp-Microarrays durch Clusteranalyse oder das automatisierte RO-Chipp-Analyseprogramm e unpredic. Mithilfe des Viro-Chipp-Microarrays wird das neuartige Influenza-H1N1-Virus aus dem Jahr 2009 leicht in der Nasenabstrichprobe eines Kindes mit grippeähnlicher Erkrankung nachgewiesen.

Außerdem haben wir gezeigt, dass der virale Chip in der Lage ist, nicht nur Atemwegsviren, sondern auch ein breites Spektrum von Viren aus verschiedenen Geweben und Körperflüssigkeiten zu identifizieren. Einige Beispiele für die Virusdetektion in Vollblut und Serum mithilfe des Vichi sind hier dargestellt. Es handelt sich um Ere-Aufrufe, die Viro-Chip-Mikroarrays aus Blutproben entsprechen, entweder aus Vollblut oder Serum, die von jeweils vier Patienten entnommen wurden. Für jede Probe sind die beiden besten Virusvorhersagen angegeben, wobei die oberste Virusvorhersage den niedrigsten P-Wert aufweist.

Beispielsweise ist bei der in hellblau hervorgehobenen Probe die bestbewertete Vorhersage für diese Probe das Dengue-Virus Typ eins. Obwohl die an zweiter Stelle klassifizierte Vorhersage das Dengue-Virus Typ zwei ist, wurde das tatsächlich in dieser Vollblutprobe vorhandene Virus eindeutig als Dengue-Virus Typ eins bestätigt, was mit den dict-Ergebnissen übereinstimmt. Eine weitere Anwendung des Viro-Chips liegt in der Entdeckung neuartiger Krankheitserreger.

Beispiele hierfür sind die Entdeckungen des SARS-Coronavirus X-M-R-V-A, des OME-Retrovirus, das mit Prostatakrebs und chronischem Erschöpfungssyndrom beim Menschen in Verbindung steht, sowie des HTCV, eines neuartigen menschlichen Kardiovirus, das mit Atemwegs- und Durchfallinfektionen bei Kindern assoziiert ist. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie in 12 Stunden durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, dass sämtliche notwendigen Geräte und Reagenzien gemäß diesem Protokoll verfügbar sind.

Andere Methoden wie die spezifische virale PCR-Amplifikation und die Tiefensequenzierung können durchgeführt werden, um ungewöhnliche Hybridisierungsmuster oder Ergebnisse von Virus-Chips zu bestätigen und weiterzuverfolgen, die auf das Vorhandensein eines neuartigen Virus hindeuten, nachdem es entwickelt wurde. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Onkologie den Weg, um die Assoziation neuartiger Viren mit Krebserkrankungen zu erforschen; im Bereich der biologischen Abwehr und der klinischen Mikrobiologie ermöglichte sie die Entwicklung kompakter, mikrobasierter Assays für eine schnelle Pathogendiagnostik sowie auf dem Gebiet der Virologie die Charakterisierung neuartiger Viren und deren Zusammenhang mit Erkrankungen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie alle Schritte des viralen Chip-Mikroarray-Assays durchgeführt werden – eines breit angelegten Überwachungstests zur Detektion viraler Pathogene in klinischen Proben, beginnend bei der Nukleinsäure-Extraktion aus klinischen Proben bis hin zur Mikroarray-Hybridisierung und -Analyse.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit klinischen Proben als biologisch gefährlich gilt und die Nukleinsäure-Extraktion in Laboren der Biosicherheitsstufe zwei oder höher durchgeführt werden sollte.