ampliPHOX kolorimetrischen Nachweis einer DNA Microarray für Influenza

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, eine neue und schnelle Signalverstärkungsmethode zur Detektion und Charakterisierung von Influenza-Virus-Subtypen auf dem Flu-Chip, einer Low-Density-Microarray-Plattform, zu nutzen. Dies wird erreicht, indem biotinylierte DTPs verwendet und Primer mit einem Phosphatrest am 5'-Ende eingesetzt werden, um das Matrix-Gen-Segment und ein nichtstrukturelles Gen-Segment aus Influenza-RNA-Extrakten zu amplifizieren. An die PCR schließt sich eine enzymatische Verdauung und Fragmentierung an, um kurze, einzelsträngige, biotinylierte und amplifizierte virale Produkte zu erzeugen, die anschließend nach Hybridisierung an den Array gebunden werden.

Die Fox-Detektion nutzt die Photopolymerisation, um an Stellen, an denen Hybridisierung auftritt, große Polymerflecken wachsen zu lassen, und verwendet differenzielle Hybridisierungsmuster zur Detektion von Influenza-Virus-Subtypen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der standardmäßigen Fluoreszenzdetektion liegt darin, dass sie vergleichsweise kostengünstig ist und ein schnelles, mit bloßem Auge sichtbares Ergebnis liefert, das eine ähnliche analytische Empfindlichkeit wie die Fluoreszenz aufweist. Obwohl diese Methode aufgrund ihrer Eigenschaft als universelle Detektionsmethode Einblicke in die Charakterisierung von Influenzaviren mithilfe des Grippe-Chips ermöglichen kann.

Ampl Fox kann auch auf eine Vielzahl anderer Systeme angewendet werden, wie beispielsweise andere DNA- und proteinbasierte Mikroarrays mit geringer Dichte. Theoretisch sollte jedes biotinylierte Produkt mittels amox nachweisbar sein. Das Verfahren wird Amber Taylor, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin, und Kevin Moulton, ein wissenschaftlicher Assistent bei Endeavor, demonstrieren, die beide in den letzten Jahren maßgeblich an der Entwicklung des Fox-Geräts und der Nachweischemie beteiligt waren.

Extrahieren Sie virale RNA aus 200 Mikrolitern Virusisolat mithilfe eines Kits zur viralen RNA-Extraktion und gemäß dem Herstellerprotokoll. Eluieren Sie mit einem Endvolumen von 60 Mikrolitern und lagern Sie die Extrakte bei minus 70 Grad Celsius oder darunter für eine spätere Verwendung. Bereiten Sie anschließend die RT-PCR-Master-Mix auf Eis gemäß dem Herstellerprotokoll vor.

Unter Verwendung einer biotinylierten dNTP-Mischung das Flu-Chip-Primer-Gemisch, das die angezeigten Konzentrationen enthält, der Master-Mischung hinzufügen. Ein Primer aus jedem Satz sollte eine 5'-Phosphatgruppe enthalten, um den enzymatischen Verdau zu erleichtern. Der Influenza-A-Primer-Satz erzeugt ein Produkt von 1032 Basenpaaren, und der Influenza-B-Primer-Satz erzeugt ein Produkt von 811 Basenpaaren.

Kurz verwirbeln und 18 Mikroliter der Master-Mix in dünwwandige PCR-Röhrchen verteilen. Anschließend zwei Mikroliter RNA-Template zu jedem Reaktionsröhrchen hinzufügen. Die PCR-Röhrchen in einen Thermocycler überführen und ein Zyklenprofil mit einer geeigneten Annealing-Temperatur verwenden.

Das beim Assay verwendete Zyklenprofil ist hier dargestellt. Bereiten Sie die enzymatische Verdauungsmischung vor, indem Sie pro PCR-Reaktion 2,2 µL Puffer für die Enzymreaktion, 0,8 µL nukleasefreies Wasser und 1,0 µL Lambda-Exonuklease-Enzym miteinander vermischen. Entnehmen Sie die Proben aus dem Thermocycler und geben Sie 4 µL zu jedem PCR-Röhrchen hinzu.

Bringen Sie die Proben zurück zum Thermocycler und programmieren Sie den Thermocycler wie angegeben auf 37 Grad Celsius für 15 Minuten, gefolgt von 95 Grad Celsius für 10 Minuten. Anschließend setzen Sie Einweg-Hybridisierungsbrücken um die zu hybridisierenden Microarrays. Waschen Sie danach die Objektträger fünf Minuten lang in 110 Milliliter gereinigtem Wasser auf einem Rotationswellen-Shaker.

Trocknen Sie die Objektträger, indem Sie vorsichtig ein Papiertuch an den Rand des Wells halten. Geben Sie 22 µL zweifach verdünnter Hybridisierungspuffer zu jedem der fragmentierten Einzelstrang-DNA-Produkte, mischen Sie kurz und pipettieren Sie 40 µL in die Microarray-Wells. Lassen Sie die Objektträger eine Stunde lang in einer Feuchtekammer hybridisieren. Entfernen Sie danach die Objektträger aus der Feuchtekammer und spülen Sie jeden Objektträger kurz mit zwei Millilitern Waschpuffer D ab. Legen Sie die Objektträger in einen Objektträgerhalter.

Fügen Sie anschließend 110 Milliliter Waschpuffer A und B unter Verwendung eines Rotationsschüttlagers in getrennte Behälter hinzu. Waschen Sie den Objektträgerhalter im Puffer A bei 60 bis 90 U/min, der Geschwindigkeit, die für alle nachfolgenden Waschschritte verwendet wird, für eine Minute. Entfernen Sie danach den Objektträgerhalter aus dem Waschpuffer A und spülen Sie ihn kurz mit Waschpuffer D ab. Überführen Sie den Objektträgerhalter in Waschpuffer B und waschen Sie ihn fünf Minuten lang auf dem Rotationsschüttler.

Nach dem Waschen die Arrays auf jedem Objektträger vorsichtig mit einem Tuch abtrocknen und die getrockneten Objektträger in die Feuchtigkeitskammer stellen. Zur Vorbereitung der Vier-Farben-Messung je Array 10 µL Amplitude, 20 µL 2x Amplitude-Puffer und 10 µL gereinigtes Wasser kombinieren, 40 µL der Markierungs-Mischung auf jedes Array übertragen und die Markierungsreaktion fünf Minuten lang in einer geschlossenen Feuchtigkeitskammer ablaufen lassen. Während der Hybridisierung 110 mL Waschpuffer C in einem Behälter vorbereiten. Unmittelbar nach der Markierung jedes Array mit Waschpuffer D spülen. Jeden Objektträger in das Objektträgergestell stellen und fünf Minuten lang auf dem Rüttler in Waschpuffer C waschen. Nach dem Waschen in Puffer C das Objektträgergestell dreimal kurz in einen Behälter mit gereinigtem Wasser eintauchen.

Um Salzrückstände zu entfernen, trocknen Sie die Arrays wie zuvor gezeigt. Bewahren Sie die Arrays in einer dunklen Objektträgerkassette auf, bis die photochemische Aktivierung und Bildgebung erfolgen, die innerhalb von 24 Stunden abgeschlossen sein sollten. Schalten Sie anschließend den Amli Fox-Leser ein und stellen Sie sicher, dass die Amli View-Software vor der Detektion der Array-Proben für die photochemische Aktivierung bereit ist.

Zunächst die optimale Photoaktivierungszeit für alle Proben anhand eines kurzen Kalibrierungsverfahrens bestimmen. Einmal pro Arbeitstag das Amplify-Reagenz auf Raumtemperatur erwärmen und kurz verwirbeln, um es zu mischen; anschließend drei Mikroliter Amplify-Enhancer in das Amplify-Röhrchen pipettieren und gründlich verwirbeln. Jeweils 40 Mikroliter der Amplify-Lösung für 10 Sekunden gleichmäßig auf nur einen Objektträger auftragen, wobei sichergestellt werden muss, dass keine Blasen entstehen.

Platzieren Sie den Microarray-Slide in der Photobestrahlungskammer des Amplify Readers. Starten Sie die Photobestrahlung, indem Sie in der PL-Ansicht-Software „Start“ auswählen und die aus dem Kalibrierungsprozess ermittelte Photobestrahlungszeit verwenden. Nach Abschluss spülen Sie den Microarray mit zwei Milliliter gereinigtem Wasser, um überschüssiges Amplify-Clear-Polymer zu entfernen. Die Polymerbildung ist nun auf Spots mit Ziel-DNA erfolgt, lässt sich aber besser visualisieren.

Nach der Färbung die Polymerflecken zwei Minuten lang trocknen lassen. Anschließend zwei Tropfen Amplex Red auf das Array geben und die Färbung zwei Minuten lang fortfahren lassen. Nach der Färbung den Objektträger schnell mit gereinigtem Wasser abspülen und wie zuvor gezeigt trocknen. Danach den Objektträger in die Bildaufnahmekammer des Amli Fox-Geräts einlegen, um mithilfe der Amli-Software ein Bild aufzunehmen und die Ergebnisse zu verarbeiten. Das linke Bild zeigt den Nachweis einer neuartigen H1N1-Probe aus dem Jahr 2009 mittels Amli Fox.

Während das Bild rechts die traditionelle Fluoreszenz eines konfokalen Fluoreszenz-Mikroarrayscanners verwendet, ist das gleiche allgemeine Nachweismuster bei beiden Methoden leicht erkennbar. Allerdings ist das Ergebnis mit Amli fox mit bloßem Auge sichtbar. Diese Bilder zeigen Flu-Chip-Ergebnisse von humanem Ursprung, H drei N zwei humaner Ursprung, H eins N eins, Schweineursprung, H eins N eins, sowie ein negatives Fuchs-Array ohne nachweisbares Influenza-Virus.

Die in Blau hervorgehobenen Sequenzen zwei und drei erzeugen Signal für alle dargestellten Influenza-A-Subtypen, doch die in der unteren rechten Ecke rot umrandeten Sequenzen erzeugen nur Signal für die Schwein-ursprüngliche H1N1-Probe. Die negative Probe zeigt ein Signal auf einer internen Kontrollsequenz, die in Grün hervorgehoben ist, was auf keine Hemmung oder Fehlfunktion der RT-PCR-Reaktion hinweist.

Wenn der gesamte Prozess einmal beherrscht ist, kann die Durchführung von der Probengewinnung über die Amoxicillin-Detektion bis hin zur endgültigen Ergebnisinterpretation innerhalb von etwa sechs Stunden abgeschlossen werden. Der Nachweisabschnitt mittels Ampl Fox, einschließlich der Gerätekalibrierung, kann im Anschluss an dieses Verfahren in etwa 30 Minuten durchgeführt werden. Andere Methoden wie die partielle oder vollständige Genomsequenzierung können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten.

Dieser Influenza-Assay dient als Erstscreening, insbesondere für Proben, die ein einzigartiges Hybridisierungsmuster ergeben. Da die Detektion ein allgemeiner Assay ist, hoffen wir, dass Forscher neue und interessante Anwendungen für Mikroarrays mit geringer Dichte finden werden, bei denen die Detektion einen Mehrwert bieten könnte.