Die Trennung Beads und Zellen in Multi-Kanal-Mikrofluidiksysteme Mit Dielektrophorese und Laminar Flow

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Zellen und Kügelchen in mikrofluidischen Vorrichtungen mittels dielektrophoretischer Kräfte oder DEP unter Verwendung von Leiterplatten (PCBs) zu manipulieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die PCB-Elektroden und die mikrofluidischen Kanäle entworfen und vorbereitet werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die mikrofluidische PCB-Baugruppe sowie die Lösungen mit Kügelchen und Zellen vorzubereiten.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Kanäle mit Medien geringer Leitfähigkeit zu füllen und anschließend die Kügelchen und Zellen zuzugeben. Der letzte Schritt des Verfahrens ist der Anschluss der PCB-Baugruppe an den Leistungsverstärker und den Funktionsgenerator und danach die Initiierung der DEP. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Trennung und Manipulation von Zellen und Kügelchen in mikrofluidischen Vorrichtungen mittels DEP zeigen.

Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da der Anwender die Prinzipien der dielektrophoretischen Kraft (DEP) verstehen muss, um eine wirksame Elektrode zu entwickeln, die in einem mikrofluidischen Gerät für die gewünschte Manipulation von Zellen oder Kügelchen funktioniert. Andererseits ermöglicht die Verwendung von Leiterplatten (PCBs) als Elektroden die Aktuierung von Zellen und Kügelchen in mikrofluidischen Vorrichtungen für eine Vielzahl wissenschaftlicher Disziplinen. Der erste Schritt dieses Verfahrens besteht darin, die Leiterplattenelektroden (PCB-Elektroden) mit der gewünschten Geometrie zu entwerfen, um ein inhomogenes elektrisches Feld zu erzeugen.

Wenn das Design abgeschlossen ist, bestellen Sie die maßgeschneiderten PCB-Elektrodenchips über eine kommerzielle Fertigungsstelle. Öffnen und inspizieren Sie nach dem Eintreffen der individuell angefertigten Leiterplatte diese zur Demonstration. Die Leiterplatte ist 8,4 Zentimeter lang und 2,1 Zentimeter breit.

Die Metallelektroden sind fünf Millimeter breit. In diesem Beispiel verfügen die Elektroden über zwei lange metallische Streifen und zwei 4,5 Millimeter lange Querbereiche, in denen die Elektroden verschränkt sind. Diese verschränkten Bereiche erzeugen ein starkes, inhomogenes elektrisches Feld, um eine Verbindung vom Stimulator zur PCB-Elektrode herzustellen.

Platzieren Sie einen 16-Gauge-Draht an der Spitze der Elektrode. Verwenden Sie ein heißes Löteisen, um den Draht im metallischen Bereich der Leiterplatte zu fixieren. Dadurch wird der Draht erhitzt.

Halten Sie das Lot an den erhitzten Draht und lassen Sie eine kleine Menge Lot in den Draht fließen. Nachdem der Draht mit Lot gefüllt ist, nehmen Sie das Löteisen weg, wobei Sie den Draht weiterhin festhalten, bis das Lot abgekühlt ist. Wiederholen Sie den Lötprozess für die andere elektrische Verbindung auf der Leiterplatte.

Der nächste Schritt besteht darin, mikrofluidische Kanäle mit dem gewünschten Verzweigungsmuster herzustellen. Erstellen Sie mithilfe standardmäßiger Mikrofertigungstechniken eine Urform zur Definition der Kanäle, indem Sie eine Siliziumscheibe und SU-8-Photoresist verwenden. Diese Urform weist einen Eingangskanal und drei Zielkanäle auf.

Die Breite der Kanäle beträgt 100 Mikrometer und die Höhe der Kanäle 27 Mikrometer. Sobald die Urform hergestellt ist, mischen Sie das Polymethyl-LAANE- oder PDMS-Elastomer mit einem Härter im Gewichtsverhältnis von 10 zu 1 fünf Minuten lang. Gießen Sie das flüssige PDMS auf die vorgefertigte SU-8-Urform und entfernen Sie Luftblasen, indem Sie das flüssige PDMS drei Minuten lang einem Vakuum aussetzen.

Wiederholen Sie den Vakuumprozess gegebenenfalls, um alle Blasen vollständig zu entfernen. Bei Bedarf kann ein Strom aus Stickstoffgas verwendet werden, um zusätzliche Blasen zu entfernen. Aushärten Sie das PDMS zwei Stunden lang bei 70 Grad Celsius im Ofen.

Verwenden Sie eine Rasierklinge, um das P-D-M-S-S-Labor mit den mikrofluidischen Kanälen vom Wafer zu entfernen. Achten Sie darauf, den Wafer nicht zu beschädigen, wobei der Kanalbereich nach oben zeigen sollte. Verwenden Sie eine Biopsiepunchvorrichtung, um Löcher für die Zufuhr von Flüssigkeiten und Zellen in die mikrofluidische Vorrichtung zu stanzen. Schneiden Sie zurecht.

Überschüssiges PDMS. Überprüfen Sie das mikrofluidische Gerät daraufhin, dass es frei von Staub und Verunreinigungen ist. Reinigen Sie das PDMS mit 3M Scotch Magic Tape.

Den PDMS-Kanälen und einer sauberen Deckglasnummer Null mit einer Dicke von 80 bis 130 Mikrometern 1,5 Minuten lang Plasma-Gas aussetzen. Entfernen Sie den PDMS-Chip und das Deckglas aus dem Plasma-Reiniger in einer Petrischale. Verbinden Sie das PDMS-Mikrofluidik-System mit nach unten gerichteten Kanälen auf dem Deckglas. Erhitzen Sie die mikrofluidische Deckglasanordnung auf einem Heizblock, der auf 100 Grad Celsius eingestellt ist, mindestens 15 Minuten lang. Der letzte Schritt bei der Vorbereitung des mikrofluidischen Geräts besteht darin, die PDMS-Kanäle und das Deckglas über den Elektroden der Leiterplatte (PCB) zu positionieren.

Beginnen Sie damit, etwa 10 Mikroliter Mineralöl auf die Leiterplatte (PCB) zu geben. Um einen engen Kontakt zwischen der Leiterplatte und der Deckglasanordnung sicherzustellen, platzieren Sie die mikrofluidische Kanalanordnung mit dem Deckglas auf die geölte Leiterplatte. Berühren Sie vorsichtig das Öl und drücken Sie die mikrofluidische Deckglasanordnung nach unten, um einen guten Kontakt zu gewährleisten und Luftblasen zu minimieren, die die Sichtbarkeit von Zellen und Kügelchen beeinträchtigen könnten.

Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Herstellung des niedrig leitfähigen Mediums, bestehend aus 8,5 % Saccharose und 0,3 % Glucose (Gewicht pro Volumen) in entionisiertem Wasser. Die mikrofluidische Vorrichtung ist nun gebrauchsfertig; füllen Sie mit einer Pipette jeden mikrofluidischen Kanal mit 15 bis 20 Mikrolitern des niedrig leitfähigen Mediums, falls erforderlich. Entfernen Sie mittels Vakuum-Aspiration eventuelle Blasen in den Kanälen.

Der nächste Schritt besteht darin, die Testpartikel in die mikrofluidische Vorrichtung einzubringen. In dieser Demonstration wird eine Suspension von 550 Polystyrolkugeln pro Mikroliter Medium mit geringer Leitfähigkeit verwendet. Da sich die Kugeln im Laufe der Zeit absetzen können, suspendieren Sie die Kugeln erneut durch Schütteln. Anschließend geben Sie mit einer Pipette 200 Mikroliter der Polystyrolkugelsuspension in den Kanal.

Der nächste Schritt besteht darin, die Elektroden vorzubereiten, indem der Ausgang eines Funktionsgenerators mit dem Eingang eines Wechselstrom-Verstärkers verbunden wird. Anschließend verbinden Sie den Ausgang des Verstärkers mit den Elektrodenkabeln. Decken Sie alle elektrischen Kabel und Oberflächen der Versuchsanordnung mit Isolierband ab, um die Benutzer vor möglichen Stromschlägen zu schützen.

Stellen Sie den Funktionsgenerator so ein, dass er eine Sinuswellenausgabe von eins bis 1,5 Megahertz erzeugt. Leiten Sie die DEP ein, um die Sortierung der Zellen und Kügelchen in diesem Aufbau zu starten. Der Zulaufkanal befindet sich rechts, und die drei Zielkanäle verzweigen sich an der dreifachen Verzweigungsstelle.

Die Leiterplatten-Elektroden entsprechen den schwarzen Streifen ohne laminare Strömung und ohne DEP. Die Kügelchen sind im Wesentlichen stationär, sobald die DEP einsetzt, jedoch ohne Strömung. Die Kügelchen wandern zu den Leiterplatten-Elektroden hin und vom Raum zwischen den Elektroden weg, wenn die laminare Strömung eingeschaltet ist.

Doch wenn die DEP abgeschaltet ist, werden die durch die Einlasskanäle strömenden Kügelchen auf die drei Zielkanäle verteilt. Wenn die DEP aktiviert wird und die laminare Strömung eingeschaltet ist, werden die Kügelchen so angeregt, dass sie ausschließlich im mittleren Kanal fließen. In den folgenden Videos wurde das mikrofluidische Gerät über den PCB-Elektroden gedreht, wodurch sich die Ausrichtung der Kanäle veränderte.

Im Hinblick auf die Leiterplatten-Elektroden: Der Zulaufkanal, der zuvor senkrecht zu den Leiterplatten-Elektroden verlief, verläuft nun bei laminarer Strömung nahezu parallel zu den Elektroden. Bei ausgeschalteter DEP treten die Kügelchen jedoch gleichmäßig in alle drei Zielkanäle ein.

Wenn die DEP initiiert wird, nähern sich die Kügelchen dem Verzweigungspunkt an, und die DEP-Kraft zieht die Kügelchen in den Seitenkanal über der Elektrode. Dieser nächste Satz von Abbildungen im Video zeigt eine Mischung aus menschlichen Kolonadenokarzinomzellen oder HT 29-Zellen und fluoreszierenden Kügelchen in der mikrofluidischen Vorrichtung. Auf diesem DIC-Bild kennzeichnet der offene Pfeil die Richtung der laminaren Strömung, und die Kanäle sind mit gestrichelten Linien hervorgehoben.

Die reflektierenden Metallelektroden sind als heller Hintergrundstreifen sichtbar, die DIC-Mikroskopie wird verwendet, um die Kügelchen während des Leuchtens abzubilden. Intensitätsskala. Die Bilder dienen dazu, die Zellen besser sichtbar zu machen.

Diese Abbildung zeigt dasselbe Bild wie die andere Abbildung, jedoch als Intensitätsbild im Glow-Scale-Modus, um sowohl die Zellen als auch die Kügelchen sichtbar zu machen. Die reflektierenden Metallelektroden erscheinen in dieser Abbildung als gelbe und grüne Streifen. Bei DEP verlassen die Kügelchen den rechten Kanal, wie im DIC-Bild gezeigt, während die HT 29-Zellen den mittleren und linken Kanal verlassen, wie im Glow-Scale-Bild vor dem Einschalten von DEP zu sehen ist. Eine Mischlösung aus Zellen und Kügelchen strömt vom einen Eingangskanal zu den drei separaten Zielkanälen.

Nach der Induktion von DEP werden die Beads und Zellen gezielt in separate Kanäle bewegt. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Dial-Elektrophorese zur Manipulation von Zellen und Beads in mikrofluidischen Vorrichtungen anwenden kann.