Einer mikrofluidischen Vorrichtung für ein Studium mehrere verschiedene Stämme

Das übergeordnete Ziel der folgenden Methode besteht darin, das Verhalten einzelner Zellen verschiedener Hefe-Stämme unter denselben dynamischen Bedingungen abzubilden. Dies wird erreicht, indem ein zweischichtiges mikrofluidisches Gerät hergestellt wird, wobei die untere Schicht jeweils die verschiedenen Stämme getrennt enthält und die obere Schicht im zweiten Schritt die dynamischen Strömungsbedingungen bereitstellt. Verschiedene Hefe-Stämme werden in die Vertiefungen gegeben und das Gerät geschlossen, wodurch ein einzelner Kanal mit mehreren getrennten Stämmen entsteht.

Als Nächstes nehmen wir die Zellantworten auf dynamische Mediumveränderungen auf. Durch die Steuerung der Durchflussraten an den beiden Eingängen des Y-Kanals zeigen die Ergebnisse verschiedene Stämme, die denselben dynamischen Bedingungen ausgesetzt sind, ohne Kreuzkontamination zwischen den Vertiefungen. Diese mikrofluidische Vorrichtung bietet mehrere entscheidende Vorteile gegenüber anderen bestehenden Systemen. Sie ermöglicht die gleichzeitige Bildgebung mehrerer unterschiedlicher Stämme unter identischen dynamischen Bedingungen.

Außerdem kann es wichtig sein, dass es in jedem Labor leicht hergestellt werden kann, ohne dass spezielle Ausrüstung erforderlich ist. Die Grundlage dieser Methode ergab sich aus der Diskussion darüber, wie die Reaktionen verschiedener wilder Ost-Isolate auf Hungerpässe verfolgt werden können. Beginnen Sie damit, das gewünschte Mikrokanal-Layout maßstabsgetreu zu zeichnen oder auszudrucken.

Danach bedecken Sie einen Objektträger mit mehreren Schichten Klebeband, um die gewünschte Höhe des Kanals zu erreichen. Legen Sie das Layout-Design auf eine ebene Oberfläche und richten Sie den Objektträger über dem Designmuster aus. Schneiden Sie nun das Klebeband auf dem Objektträger vorsichtig gemäß dem Layout zu. Entfernen Sie das Klebeband aus allen Bereichen des Objektträgers.

Akzeptieren Sie diese in der Anordnung des Mikrokanals. Stellen Sie den Objektträger drei Minuten lang in einen Heizofen mit 65 Grad Celsius. Reinigen Sie ihn anschließend vorsichtig mit Ethanol.

Mischen Sie die Basis- und Härterkomponenten von PDMS gemäß den Herstellerangaben. Gießen Sie etwa 30 Milliliter der PDMS-Mischung in eine Petrischale bis zu einer Höhe von ungefähr 0,5 Zentimetern. Entgasen Sie das PDMS bei Bedarf im Vakuum.

Legen Sie die Glasplatte mit der strukturierten Klebefolie nach oben in das PDMS. Durch das Platzieren des Musters nach dem Gießen des PDMS wird die Bildung von Luftblasen zwischen der Platte und dem Boden der Schale verhindert. Aushärten lassen für 48 Stunden bei 65 Grad Celsius, wobei sichergestellt werden muss, dass die Schale mithilfe einer Wasserwaage horizontal steht, in einer neuen 90-Millimeter-Petri-Schale. Gießen Sie drei Milliliter PDMS-Mischung ein.

Dieser Schritt kann bei Vorhandensein auf einem Spin-Codierer durchgeführt werden. DGAs und Aushärtung wie zuvor gezeigt. Schneiden Sie nun vorsichtig die Flussschicht des mikrofluidischen Geräts mit einem Biopsie-Locher auf die gewünschte Größe zu.

Erstellen Sie Löcher für die Ein- und Auslässe in der Durchflussschicht. Schneiden Sie außerdem eine ebenso große Brunnen-Schicht aus der zweiten Petrischale aus und platzieren Sie sie auf einem dicken Glas. Verschieben Sie das Design-Layout darüber.

Stanzen Sie anschließend mit Ethanol Vertiefungen aus, die mit den Mikrokanälen des Layouts ausgerichtet sind, reinigen Sie beide PDMS-Schichten sowie eine Glasdeckenscheibe und lassen Sie sie lufttrocknen. Behandeln Sie danach die Glasdeckenscheibe und die PDMS-Schicht mit den Vertiefungen entweder mit einem Standard-Plasmaätzer für eine nicht reversible Bindung oder mit einem handgeführten Corona-Behandler für eine reversible Bindung. Legen Sie die Schicht mit den Vertiefungen vorsichtig auf die Deckenscheibe, um eine Haftung zu erzielen.

Vorsichtig alle Luftblasen herausreiben. Das gewünschte Medium in geeigneten Spritzen vorbereiten und mit der durch eine Spritzenpumpe geführten Tigon-Schlauchleitung verbinden. Für die Zellbildgebung.

Nutzen Sie die Stärken. Gehen Sie zur gewünschten Phase, wirbeln Sie die Kultur gründlich um und übertragen Sie 300 Mikroliter in Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie vorsichtig ein Mikroliter Con Cana A in jedes Brunnen der PDMS-Brunnenschicht.

Spülen Sie überschüssiges Conna A durch vorsichtiges Pipettieren von Wasser je zweimal aus jedem Well aus, während das Con in A trocknet. Waschen Sie die Stämme zweimal mit 300 Mikrolitern SC-Medium ohne Glukose. Das Entfernen von restlichem Glukose aus den Zellwänden fördert eine ordnungsgemäße Haftung an der Conval.

Nach dem Vortexen pipettieren Sie etwa 0,5 Mikroliter der Zellsuspension mithilfe einer Pipette gründlich in einzelne Vertiefungen. Spülen Sie restliche Zellen vorsichtig mit reichhaltigem Medium aus. Die nächsten beiden Schritte müssen schnell durchgeführt werden, um zu verhindern, dass die Zellen austrocknen.

Optional kann Plasma verwendet werden, um den Chip und die Vertiefungen zu behandeln, wobei darauf geachtet werden sollte, die Vertiefungen nicht direkt zu treffen. Danach den Chip unter einem Stereomikroskop vorsichtig auf die Vertiefungen setzen und besonders auf die Ausrichtung zwischen beiden achten. Sanft andrücken, um die beiden PDMS-Schichten miteinander zu verbinden.

Füllen Sie das Gerät langsam vollständig mit etwa 50 Mikrolitern reichhaltigem Medium, wobei sichergestellt werden muss, dass sich keine Luftblasen im Kanal befinden. Schließen Sie nun das Gerät an, indem Sie die Schläuche in die entsprechenden Einlässe einführen, und beginnen Sie den Mediumfluss. Achten Sie darauf, dass keine Luftblasen in den Schläuchen entstehen, da diese im Gerät hängen bleiben und den Fluss stören können.

Bringen Sie das Gerät unter dem Mikroskop an und suchen Sie geeignete Bildgebungsstellen in jedem Probenträger. Halten Sie die Zellen für eine Stunde oder länger, falls erforderlich, unter reichhaltigem mittlerem Durchfluss, um die Regeneration zu ermöglichen.

Beginnen Sie das Experiment mit einer konstanten Durchflussrate. Stellen Sie Pumpe A auf 0,8 Milliliter pro Stunde und Pumpe B auf 0,2 Milliliter pro Stunde. Für Medium a, das über 80 % der Breite des Kanals fließt.

Wir können die Bedingungen im Gerät dynamisch ändern, indem wir die relativen Durchflussraten anpassen. Die neuen Bedingungen stabilisieren sich innerhalb von Sekunden entlang des gesamten Kanals. Um die Trennung zwischen verschiedenen Stämmen zu demonstrieren, werden zwei unterscheidbare Hefe-Stämme in abwechselnden Vertiefungen abgebildet.

Beachten Sie, dass in diesem Experiment kein Zellaustritt zwischen den Vertiefungen auftritt. Beide Stämme enthalten den mit YFP markierten Transkriptionsfaktor MSN2, um den simultanen Effekt sich dynamisch ändernder Bedingungen zu testen. Die Durchflussraten in den beiden Zufuhrkanälen wurden geändert, um einen Schritt mit glucosefreiem Medium zu erzeugen.

Dies führte zur Lokalisation von MSN zwei im Kern. Wichtig ist, dass die zeitliche Entwicklung der nukleären MSN-zwei-YFP-Konzentration in einzelnen Zellen analysiert werden kann. So kann das PDMS-Mikrofluidik-System verwendet werden, um mehreren Vertiefungen gleichzeitig dynamische Bedingungen zuzuführen.

Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, dass die Zellen während der Montage des Geräts nicht austrocknen. Sobald man die Technik beherrscht, kann sie problemlos ohne die Notwendigkeit der weichen Lithographie durchgeführt werden.