Effiziente Polyethylenglykol (PEG) vermittelten Transformation von der Moss Physcomitrella patens
19. April 2011
Eine einfache und effiziente Methode zur Umwandlung Physcomitrella pantens Protoplasten beschrieben. Diese Methode wird von Protokollen für angepasste Physocmitrella Protonema Protoplasten und Arabidopsis Mesophyll Protoplasten-Transformation 1.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, SCO-Metre-Protoplasten zu transformieren. Dies wird erreicht, indem die Pflanzen zunächst mit Drizly verdaut werden. Anschließend werden die Protoplasten mit Mannit gewaschen, um das Drizly zu entfernen, und danach mit DNA und PEG inkubiert.
Schließlich werden die transformierten Protoplasten auf Platten ausgestrichen und inkubiert. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die transformierte Protoplasten zeigen, welche fluoreszenzmarkierte Proteine durch Fluoreszenzmikroskopie exprimieren. Die Durchführung der Methode wird Y. Lu, ein Postdoktorand aus meinem Labor, demonstrieren.
Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie wirksam ist und zuverlässig Protoplasten erzeugt, die das Protein der Interesse exprimieren. Um Moosprotoplasten zu isolieren, geben Sie zunächst neun Milliliter 8 % Mannitol mit einem Spatel in eine Petrischale. Geben Sie fünf bis sieben Tage altes Moos von zwei bis drei PP NH vier-Platten in das Mannitol. Weitere Informationen zu diesem und zusätzlichen Reagenzrezepturen finden Sie im beigefügten schriftlichen Protokoll. Fügen Sie danach drei Milliliter 2 % Drizly hinzu und inkubieren Sie eine Stunde bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln.
Filtrieren Sie die Mischung durch ein 100-Mikron-Sieb, um eine grüne homogene Suspension zu erhalten. Zentrifugieren Sie dann das Filtrat bei 250 ×g fünf Minuten lang. Entsorgen Sie das Überstandvolumen dabei sehr vorsichtig.
Suspendieren Sie die Protoplasten in 500 Mikrolitern 8%igem Mannitol. Geben Sie anschließend weitere 9,5 Milliliter 8%iges Mannitol hinzu. Stellen Sie sicher, dass die Protoplasten vollständig suspendiert sind.
Führen Sie die Waschschritte noch zweimal durch, indem Sie die Lösung erneut bei 250 G fünf Minuten lang zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Protoplasten zunächst in 500 Mikrolitern.
Dann 9,5 Milliliter 8 % Mannit mit einem Hämocytometer. Zählen Sie die Anzahl der Protoplasten in 10 Mikroliter der Suspension, um DNA in die isolierten Protoplasten einzubringen. Zentrifugieren Sie zunächst die Protoplastenmischung bei 250 ×g für fünf Minuten.
Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Protoplasten in MMG-Lösung mit einer Dichte von 1,6 Millionen pro Milliliter. Inkubieren Sie die Suspension 20 Minuten bei Raumtemperatur. Geben Sie danach 600 Mikroliter der Protoplastenlösung in ein Kulturgefäß, das 60 Mikrogramm DNA enthält. Schütteln Sie vorsichtig.
Geben Sie vorsichtig 700 Mikroliter PEG-Calciumlösung hinzu und schütteln Sie. Inkubieren Sie die Probe während dieser Wartezeit gründlich 30 Minuten bei Raumtemperatur. Bedecken Sie die PRMB-Platten mit Cellophan.
Anschließend die Suspension mit drei Millilitern W5-Lösung verdünnen und fünf Minuten bei 250 ×g zentrifugieren. Um das PEG zu entfernen, die Protoplasten in zwei Millilitern PRMT resuspendieren und je ein Milliliter pro PRMB-Platte, die mit Zellophan bedeckt ist, auftragen. Die Platten bei 25 Grad Celsius in einer Wachstumskammer aufbewahren.
Schließlich die Zellulosemembran vier Tage nach der Transformation auf frische Selektionsplatten überführen. Diese Abbildung zeigt ein Beispiel für 18 Tage alte Pflanzen, die aus Protoplasten regeneriert wurden und mit 15 Mikrogramm supercoiled Plasmid-DNA transformiert wurden, die ein Hygromycin-Resistenzkassette trägt. Hier wurden 30 Mikrogramm desselben supercoiled Plasmids in Protoplasten transformiert.
60 Mikrogramm Plaid-DNA wurden in dieser Probe transformiert. Und schließlich wurden diese Pflanzen aus Protoplasten regeneriert, die mit 120 Mikrogramm derselben supercoiled Plasmid-DNA, die die Hygromycin-Resistenzkassette trägt, transformiert wurden. Die Transformations-Effizienz wird durch DNA-Konzentrationen von bis zu 60 Mikrogramm nicht beeinträchtigt.
Allerdings sind höhere DNA-Konzentrationen für dieses Verfahren nachteilig. Die Daten zeigen, dass diese Methode über einen weiten Bereich an DNA-Mengen hinweg konsistente Ergebnisse liefert Einmal pro Semester. Diese Technik kann innerhalb von drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie ordnungsgemäß ausgeführt wird.
Mit dieser Methode können zusätzliche Verfahren wie transiente RNAi und Gen-Knockouts durchgeführt werden, um weitere Fragen zur Genfunktion zu beantworten.
Übersicht
Dieser Artikel beschreibt eine einfache und effiziente Methode zur Transformation von Protoplasten von Physcomitrella patens. Die Technik ist von bestehenden Protokollen für die Protoplastentransformation abgeleitet und zielt darauf ab, durchgängig erfolgreiche Ergebnisse zu erzielen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Pflanzenbiologie
- Genetische Ingenieurtechnik
- Zellbiologie
Hintergrund
- Protoplasten sind Pflanzenzellen, bei denen die Zellwände entfernt wurden.
- Transformationsmethoden sind entscheidend, um die Genfunktion in Pflanzen zu untersuchen.
- Physcomitrella patens dient als Modellorganismus in der Pflanzenforschung.
- Bestehende Methoden zur Protoplastentransformation können komplex und zeitaufwendig sein.
Zweck der Studie
- Eine optimierte Protokollvariante für die Transformation von Physcomitrella patens-Protoplasten bereitstellen.
- Die Effizienz und Zuverlässigkeit der Protoplastentransformation verbessern.
- Weitere genetische Untersuchungen an Moosen erleichtern.
Verwendete Methoden
- Verdauung von Moosgewebe mit Drizly zur Isolierung von Protoplasten.
- Waschen der Protoplasten mit Mannit zur Entfernung von Verunreinigungen.
- Transformation isolierter Protoplasten mit DNA unter Verwendung von PEG.
- Inkubation der transformierten Protoplasten auf selektivem Medium.
Hauptergebnisse
- Transformierte Protoplasten exprimierten erfolgreich fluoreszierende Proteine.
- Die Methode zeigte eine konsistente Transformations-Effizienz über verschiedene DNA-Konzentrationen hinweg.
- Höhere DNA-Konzentrationen erwiesen sich als nachteilig für den Transformationserfolg.
- Das gesamte Verfahren kann in etwa drei Stunden abgeschlossen werden.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode bietet einen zuverlässigen Ansatz zur Transformation von Physcomitrella patens-Protoplasten.
- Sie ermöglicht anschließende Experimente wie transiente RNAi und Gen-Knockouts.
- Das Protokoll kann wesentlich zum Verständnis der Genfunktion in Moosen beitragen.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Die PEG-vermittelte Transformation von Physcomitrella patens-Protoplasten ermöglicht eine effiziente und reproduzierbare Genübertragung und unterstützt so die funktionelle Genomik mit hohem Durchsatz in Pflanzensystemen. Diese Fähigkeit ist entscheidend für frühe Entdeckungsteams, die die Genfunktion untersuchen, Zielstrukturen validieren und die Aufklärung von Signalwegen in einem genetisch zugänglichen Modell beschleunigen möchten. Die Skalierbarkeit und das Potenzial zur Standardisierung der Methode machen sie wertvoll für genetische Bildschirme und die mechanistische Risikominderung über das gesamte Portfolio hinweg.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die schnelle Untersuchung der Genfunktion durch effiziente DNA-Übertragung in Mooszellen.
- Ermöglicht eine Genzielmodifikation mit hoher Frequenz zur funktionellen Validierung von Zielstrukturen und zur Analyse von Signalwegen.
- Unterstützt die mechanistische Risikominimierung, indem präzise genetische Modifikationen in einem Modellsystem ermöglicht werden.
- Erhöht die Vorhersagesicherheit für nachgeschaltete biologische Hypothesen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Ermöglicht einen standardisierten Protokollablauf zur Erzeugung einer großen Anzahl von Transformanten für Screening-Assays.
- Stellt reproduzierbare Transformations-Effizienz bereit und unterstützt damit die Zuverlässigkeit und Skalierbarkeit von Assays.
- Ermöglicht die Herstellung validierter biologischer Systeme für die Bewertung von Verbindungen und phänotypische Screening-Verfahren.
- Verringert die Abhängigkeit von spezieller Ausrüstung und erhöht so die Zugänglichkeit für Teams, die an der Assay-Entwicklung arbeiten.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht downstream-Anwendungen wie transiente RNAi- und Gen-Knockout-Studien, die für die Krankheitsmodellierung relevant sind.
- Unterstützt die Kontinuität von der Genentdeckung bis zur präklinischen Validierung in pflanzlichen Systemen.
- Bietet eine Plattform zur translationellen Biomarkerforschung, wenn sie mit krankheitsrelevanten Signalwegen kombiniert wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses Transformationsprotokoll integriert sich in den Bereich von der frühen Entdeckung bis zur Identifizierung von Leitverbindungen und ermöglicht genetische Manipulationen, Zielvalidierung und Assay-Entwicklung in Pflanzenmodellen.
- Entdeckungsbasierte Biologie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch effiziente Genübertragung und Expressionsanalyse.
- Screening: Unterstützt die Bereitschaft und Reproduzierbarkeit von Assays durch die Erzeugung konsistenter transformierter Populationen.
- Analytik: Liefert quantitative Ergebnisse wie Transformationswirksamkeit und Proteinausprägung für den vergleichenden Analysenansatz.
- Translationale Forschung: Ermöglicht genetische Studien, die die Entwicklung präklinischer Modelle und die Identifizierung von Biomarkern unterstützen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine breit anwendbare, standardisierte Transformationsfähigkeit für vielfältige genetische Untersuchungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten bei der Untersuchung von Genfunktionen.
- Operationaler Wert: Bietet Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit für genetische Transformationsabläufe.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung hinsichtlich Fortführung oder Abbruch von Projekten sowie die Kapitalnutzung, indem robuste Daten aus frühen Entwicklungsstadien generiert werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung genetischer Zielstrukturen und Signalwege.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Kultur pflanzlicher Zellen und sterilen Techniken zur Isolierung und Transformation von Protoplasten.
- Benötigt Zugang zu einer grundlegenden Laborinfrastruktur, einschließlich Zentrifugation und Fluoreszenzmikroskopie zur Validierung der Ergebnisse.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen hinsichtlich der Transformationsparameter, um die Reproduzierbarkeit über verschiedene Projekte hinweg sicherzustellen.
- Kann Anpassungen erfordern, um in anderen Pflanzenarten oder Modellsystemen außerhalb von Physcomitrella patens eingesetzt zu werden.
- Die Transformationsrate ist empfindlich gegenüber der DNA-Konzentration, wobei höhere Mengen schädlich wirken können.
