Microarray-Analyse für Saccharomyces cerevisiae

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Studierende der Naturwissenschaften in die Microarray-Technologie einzuführen, indem Expressionsunterschiede in Hefe während oxidativen Stresses untersucht werden. Dies wird erreicht, indem zunächst Gesamt-RNA aus Hefekulturen isoliert wird, die mit Wasserstoffperoxid behandelt wurden, sowie aus unbehandelten Kontrollen. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, aus diesen RNA-Proben cDNA zu erzeugen und zu reinigen.

Die cDNA wird anschließend verwendet, um über eine In-vitro-Transkription biotinmarkierte cRNA herzustellen. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Fragmentierung der biotinmarkierten cRNA, um sie anschließend an die AFI-Metrik-Hefe-Genchips hybridisieren zu können. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Expressionsunterschiede zwischen den beiden Hefeproben zeigen und mithilfe der Bioinformatik die Leistungsfähigkeit der Microarray-Analyse Studierenden im Bachelorstudium veranschaulichen.

Das Outreach-Team des Vermont Genetics Network hatte die Idee zu dieser Methode, als es beauftragt wurde, Schülern im gesamten Bundesstaat Vermont die Microray-Technologie zugänglich zu machen, um deren naturwissenschaftliche Bildung zu verbessern. Bislang wurde diese Methode an mehreren Standorten an acht Bachelor-Colleges im Bundesstaat eingeführt. Der Hauptvorteil der Verwendung von Microray-Modulen für den Unterricht liegt darin, dass wir dadurch in der Lage sind, allgemeine molekularbiologische Techniken, die täglich im Labor angewandt werden, einer Gruppe von Personen beizubringen.

Und wir nutzen dies auch, um Studierenden, Lehrkräften und unseren Gruppen beizubringen. Tatsächlich arbeiten Studierende und Professoren gemeinsam an demselben Projekt. Sie erlernen bestimmte Techniken, die viel Fingerspitzengefühl erfordern, wie das Umgang mit RNA, was keine leichte Aufgabe ist.

Sie lernen, wie man DNA mithilfe von Visualisierungsreagenzien präzipitiert. Tatsächlich wenden sie die Techniken an, auf die sie in ihrem Graduiertenstudium oder im alltäglichen molekularbiologischen Labor treffen werden. Obwohl diese Methode geeignet ist, Einblicke in oxidativen Stress und Hefe zu gewinnen, kann sie sicherlich auch auf andere Modellorganismen und andere biologische Systeme angewendet werden, die Sie untersuchen möchten.

Genexpressionsänderungen, unabhängig davon, ob sie mit Entwicklungsveränderungen, Umweltgiften, bestimmten Krankheitszuständen oder zahlreichen anderen Faktoren assoziiert sind. Um die Expressionsunterschiede in Hefe während oxidativem Stress zu untersuchen, wird zunächst Gesamt-RNA aus zwei Hefekulturen durch enzymatische Lyse extrahiert. Eine Kultur wurde einem oxidativen Stress durch eine einstündige Behandlung mit 0,5 Millimolar Wasserstoffperoxid in Hank’s Buffered Saline ausgesetzt, während die andere Kultur nur mit HBSS als Kontrolle behandelt wurde.

Beginnen Sie damit, zwei 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit den entsprechenden Identifikationsangaben zu beschriften. Geben Sie jeweils 1,5 Milliliter der geeigneten Hefekultur in jedes Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen zwei Minuten lang bei 5.000 × g und Raumtemperatur.

Nach der Zentrifugation das Überstand mit einer Mikropipette vorsichtig entfernen und verwerfen, ohne den Pellet zu stören. Überprüfen Sie, ob der Pellet groß genug ist, bevor Sie mit dem Verfahren fortfahren. Falls der Pellet zu klein ist, geben Sie 1,5 Milliliter Kultur in das gleiche Röhrchen mit dem Pellet und zentrifugieren Sie erneut, um einen größeren Pellet zu erhalten.

Entfernen Sie den Überstand mit einer Mikropipette, wobei so viel Flüssigkeit wie möglich vom Hefepellet abgesaugt wird. Geben Sie anschließend 100 µL SG-Puffer und 30 µL Liase-Lösung zum Hefepellet hinzu und wirbeln Sie die Mischung kurz im Vortex. Inkubieren Sie beide Röhrchen 30 Minuten bei Raumtemperatur während der Inkubation.

Schwenken Sie jedes Gefäß vorsichtig alle 10 Minuten, um Platten zu erzeugen. Einer der kritischsten Schritte beim Sphäro-Plattieren von Hefe ist sicherzustellen, dass tatsächlich eine hundertprozentige Sphäro-Plast nach der Behandlung erzeugt wurde. Das bedeutet, dass nicht alle lytischen Enzyme gleich wirksam sind.

Sie müssen also überprüfen, ob ein guter lytischer Enzymansatz eine gute Sphäroplastenbildung ergibt, was bedeutet, dass Sie diese Proben nehmen, auf einen Objektträger geben und unter dem Mikroskop nach Zugabe von 0,1 % SDS auf die Bildung von Protoplasten prüfen müssen. Um eine vollständige Sphäroplastenbildung zu beobachten, pipettieren Sie 10 Mikroliter der Hefe-Probe auf einen Objektträger und untersuchen die Probe dabei unter dem Mikroskop, nachdem Sie einen Mikroliter 0,1 % SDS zugegeben haben, um die Hefezellen anschwellen zu lassen und perfekte Kugeln oder Sphäroide entstehen zu lassen. Es ist wichtig sicherzustellen, dass auch die teilungsaktiven Zellen S-förmige Sphäroide bilden.

Wenn eine partielle Sphero-Plättung beobachtet wird, wird eine verlängerte Behandlung mit Liase empfohlen. Sobald die vollständige Sphero-Plättung bestätigt ist, 350 Mikroliter BRLT-Puffer zu jedem Röhrchen geben, anschließend 250 Mikroliter 100 %igen Ethanol hinzufügen. Sicherstellen, dass das Röhrchen fest verschlossen ist, indem der Deckel geschlossen gehalten und kräftig für eine Minute verwirbelt wird.

Dieses Verfahren wird die Sphero-Platten lysieren. Danach verwenden Sie R- und easy Z-Spin-Säulen, um die RNA aus den beiden Kulturen zu sammeln und zu reinigen. Schließlich bewerten Sie die Qualität der extrahierten RNA mittels 1,2 %iger vorgegossener Agarose-Gelelektrophorese, um biotinmarkiertes cRNA herzustellen.

Die aus den Hefe-Zellen extrahierte Gesamt-RNA wird zunächst zur Synthese von CDNA durch Reverse Transkription verwendet. Nach der CDNA-Generierung bereiten Sie Phasentrenngel-Röhrchen für die CDNA-Fällung vor, indem Sie die Phasentrenngel-Röhrchen eine Minute lang mit maximaler Geschwindigkeit zentrifugieren, um sicherzustellen, dass das Gel am Boden des Röhrchens liegt. Vortexen Sie die Phasentrenngel-Röhrchen nicht, um die CDNA zu präzipitieren. Pipettieren Sie 162 Mikroliter der unteren Schicht einer mit Tris gepufferten Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Mischung (PCI) bei pH 8,0 und geben Sie dies zu den 162 Mikrolitern des Inhalts des Reaktionsröhrchens der zweiten Strang-CDNA-Synthese. Für diesen Schritt sind gleiche Volumina wässriger und organischer Mischungen erforderlich.

Versetzen Sie durch Vortexen für fünf Sekunden, um den Inhalt zu mischen. Verwenden Sie anschließend eine Mikropipette, um die gesamte CD N-A-P-C-I-Mischung in das Phasentrenngelröhrchen zu überführen. Vortexen Sie das Phasentrenngelröhrchen nicht, sondern zentrifugieren Sie es zwei Minuten lang mit voller Geschwindigkeit.

Verwenden Sie dann eine Mikropipette, um die obere Schicht aus dem Phasentrenngel-Röhrchen in ein neu beschriftetes 1,7-Milliliter-Röhrchen zu überführen. Versuchen Sie, so viel wie möglich von dieser Schicht zu gewinnen. Geben Sie Folgendes zu dem 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen hinzu: 405 Mikroliter 100 % Ethanol, 80 Mikroliter Ammoniumacetat und ein Mikroliter Pellet-Paint-Vortex.

Stellen Sie das Röhrchen kurz in die Zentrifuge, wobei das Scharnier des Röhrchens nach außen zeigen soll, und zentrifugieren Sie 20 Minuten bei maximaler Drehzahl. Nach Beendigung der Zentrifugation bei Raumtemperatur entfernen Sie das Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge, wobei Sie darauf achten sollten, das CD-NA-Pellet nicht aufzuwirbeln. Das Pellet sollte aufgrund der Pellet-Farbe rosa sein und ungefähr die Größe eines Salzkorns haben.

Und auf der Seite des Röhrchens unter dem Scharnier das CD NA-Pellet auf Eis legen und unverzüglich mit der Reinigung des Pellets fortfahren. Um die Reinigung des CD NA-Pellets zu beginnen, verwenden Sie eine P 1000-Mikropipette, um vorsichtig den gesamten Überstand aus dem Röhrchen zu entfernen. Achten Sie darauf, das Pellet nicht aufzuwirbeln.

Geben Sie Ihre Probe mit 500 Mikrolitern kaltem, 80%igem Ethanol in das Röhrchen. Verschließen Sie das Röhrchen vorsichtig und stürzen Sie es langsam mehrmals um. Achten Sie sehr genau auf Ihren Pellet, um sicherzustellen, dass er nicht von der Wand des Röhrchens abgelöst wird.

Falls das Pellet sich löst, kann es wieder an den Röhrchenboden gebracht werden, indem das Röhrchen zurück in das Gestell gestellt und das Pellet absinken gelassen wird, oder indem das Röhrchen 15 Sekunden lang mit voller Geschwindigkeit zentrifugiert wird. Verwenden Sie anschließend eine P-1000-Mikropipette, um vorsichtig das Ethanol zu entfernen, ohne das Pellet zu stören. Kippen Sie das Röhrchen, um so viel Flüssigkeit wie möglich zu entnehmen.

Geben Sie eine neue Eloqua mit kaltem, 80%igem Ethanol hinzu, verschließen Sie das Röhrchen und drehen Sie es langsam mehrmals um. Entfernen Sie mit einer P-1000-Mikropipette so viel Ethanol wie möglich. Zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Sekunden lang mit maximaler Geschwindigkeit.

Verwenden Sie dann eine P 10-Mikropipette, um die letzten Mikroliter Ethanol zu entfernen, ohne den Pellet zu stören. Stellen Sie den offenen Probengefäß in eine Trocknungsdose und lassen Sie das verbleibende Ethanol 10 bis 20 Minuten lang verdunsten. Der Pellet kann leicht verloren gehen, sobald er trocken ist; gehen Sie daher vorsichtig mit dem Probengefäß um und schließen Sie die Kappe sorgfältig.

Wenn das Trocknen abgeschlossen ist, das getrocknete Pellet sichtbar machen, um dessen Vorhandensein im Röhrchen zu bestätigen. Abschließend das getrocknete Pellet in 22 µL RNA-freiem Wasser resuspendieren und das Röhrchen auf Eis stellen. Diese cDNA wird anschließend verwendet, um biotinmarkierte cRNA durch in-vitro-Transkription mit dem Enzo BioArray Kit herzustellen.

Nachdem die mit Biotin markierte cRNA gereinigt und quantifiziert wurde, erfolgt die Fragmentierung zur Target-Präparation. Sobald die cDNA erzeugt wurde, verwenden wir eine Standard-In-vitro-Transkriptionsmethode, um biotinylierte cRNA herzustellen. Die cRNA muss vor der Applikation auf den Mikroarray-Chip fragmentiert werden.

Um dieses Verfahren zu beginnen, überführen Sie eine Menge, die fünf Mikrogramm CRNA entspricht, in ein beschriftetes 0,5-Milliliter-PCR-Röhrchen. Geben Sie so viel RNA-freies Wasser hinzu, dass das Gesamtvolumen 16 Mikroliter beträgt, und fügen Sie anschließend vier Mikroliter 5x-Fragmentierungspuffer dem Röhrchen hinzu. Das Gesamtvolumen im Röhrchen sollte 20 Mikroliter betragen.

Schwenken Sie das Reagenzglas und zentrifugieren Sie es 10 Sekunden lang. Anschließend inkubieren Sie das Reagenzglas 30 Minuten bei 94 Grad Celsius. Stellen Sie das Reagenzglas im Thermocycler nach der Inkubation auf Eis.

Die fragmentierte und nicht fragmentierte cRNA aus jeder Probe wird anschließend mittels Elektrophorese unter Verwendung eines vorgefertigten 1,2 %-AROS-Gels analysiert. Nach Beendigung des Laufs wird das Gel auf einem Transilluminator sichtbar gemacht und ein Bild aufgenommen. Das endgültige Syntheseprodukt wird an die Atriplex-Hefe-Genchips hybridisiert, und hier sind repräsentative Ergebnisse der Microarray-Analyse dargestellt.

Diese erste Abbildung zeigt ein Beispiel für ein gescanntes Atrics-Hefe-Gen-Chip-Bild, das mit der Atrics-Gen-Chip-Betriebssoftware erzeugt wurde. Es handelt sich um ein zweidimensionales Streudiagramm aller genetischen Transkripte, etwa 6.700 Gene, das Kontroll- und behandelte Hefe-Daten vergleicht. Jeder Punkt repräsentiert ein einzelnes Gen.

Gene, die in Lila gefärbt sind, weisen eine differenzielle Expression auf, während Gene in Rot nicht differentiell exprimiert sind. In diesem Beispiel handelt es sich bei den meisten differentiell exprimierten Genen um Gene, die an der Kontrolle des Zellzyklus beteiligt sind, wie ihre Beschreibungen anzeigen. Dieses Flussdiagramm aus der Datenbank für Annotation, Visualisierung und integrierte Entdeckung veranschaulicht differentiell exprimierte Gene in einem betroffenen biologischen Signalweg.

Die Gene, die mit einem roten Stern gekennzeichnet sind, zeigen die herunterregulierten Gene im meiotischen Signalweg an. Abschließend werden hier repräsentative Ergebnisse eines Vulkandiagramms gezeigt, das mit der Geo Species Gene Sifter-Software erstellt wurde. Kontroll- und behandelte Proben wurden mit einem P-Wert-Grenzwert von 0,05 und einer Expressionsschwelle von 1,5-facher Änderung verglichen.

Wir entschieden uns für die Verwendung von Hefe, da Hefe schnell und einfach zu kultivieren ist, doch wir erkannten auch, dass der entscheidende Schritt bei der Arbeit mit Hefe tatsächlich die Herstellung einer geeigneten Sphäro-Plattierung darstellt. Eines der Dinge, die wir bei einem Microarray-Experiment vermeiden möchten, ist eine unvollständige Verdauung, die lediglich Zellen in der G1- oder G2/M-Phase sphäroplastiert. Andernfalls führt man ein Microarray-Experiment an Hefezellen durch, die sich in einer bestimmten Replikationsphase befinden.

Ein weiterer komplizierter Aspekt, den wir in dieser Übung verdeutlichen möchten, ist das Pelletieren von DNA, worüber täglich gesprochen wird, der Vorgang jedoch nicht unbedingt einfach ist. In unserem Modul haben wir spezielle Röhrchen und Visualisierungsreagenzien verwendet. So können wir DNA tatsächlich abzentrifugieren und das Pellet sichtbar machen, was sowohl für Schüler als auch für Lehrkräfte die Handhabung erleichtert.

So kann es in allen Phasen der DNA- und RNA-Arbeit nach seiner Entwicklung verwendet werden. Dieses Modul hat den Weg dafür geebnet, dass Dozenten an Bachelor-Instituten neue Ansätze erforschen können, beispielsweise durch die Untersuchung weiterer Modellorganismen oder alternativer Behandlungsregime, die möglicherweise mit bestehenden Lehrplänen oder auch mit ihren eigenen Forschungsinteressen vereinbar sind. Um Ihnen einige Beispiele für durchgeführte Modifikationen zu nennen: Eine Einrichtung untersuchte die Wirkung einer Herbizidbehandlung auf Hefe, eine andere analysierte die LAMP-IDE-Behandlung in Hefe, während eine dritte Einrichtung die Entwicklungsveränderungen in einer Säugetierzelllinie untersuchte, die sie besonders interessierte.

Und schließlich hat eine weitere Arbeitsgruppe die Auswirkungen unterschiedlicher Lichtquellen auf Arabidopsis oder Pflanzen untersucht. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein Mikroarray-Experiment mit Studierenden der Naturwissenschaften durchführt, einschließlich der Isolierung von Gesamt-RNA aus Hefe, der Erzeugung von cDNA und der Fragmentierung biotinmarkierter cRNA. Praktische Erfahrungen mit solch hochentwickelten Technologien tragen dazu bei, die naturwissenschaftliche Ausbildung von Studierenden zu festigen und zu stärken.