Bestimmung genetischer Expressionsprofile in C. elegans Verwenden Microarray-und Real-time PCR

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Genexpressionsprofile zu untersuchen, die zahlreichen Phänotypen oder Stoffwechselwegen zugrunde liegen. Dies wird erreicht, indem zunächst mRNA aus zwei kontrastierenden Nematodenstämmen isoliert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, CD NA zu synthetisieren, die entweder S SI drei- oder SFI-Erfassungssequenzen enthalten, und diese an ein Microarray zu hybridisieren.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, das Microarray mit Anti-Capture-Sequenzen zu hybridisieren, die S SI drei und SCIFI Fluoro vier enthalten. Der letzte Schritt des Verfahrens ist das Scannen des Microarrays und die Analyse der Daten mithilfe bioinformatischer Werkzeuge wie der Magic Tool-Software. Letztendlich werden Kandidatengene identifiziert, die für das untersuchte biologische Phänomen verantwortlich sind, und können durch alternative Techniken wie die Echtzeit-PCR validiert und quantifiziert werden.

Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da die aufgetragenen Nukleotide für den Benutzer nicht sichtbar sind, weshalb es schwierig ist, eine homogene Hybridisierungslösung gleichmäßig über die über 23.000 spezifisch aufgebrachten Nukleotide zu verteilen. Beginnen Sie, indem Sie RNA aus gesunden, synchronisierten Nematoden isolieren. Zunächst werden sie in 15-Milliliter-Röhrchen gewaschen und resuspendiert, und die pelletierten Wurmpellets werden in sieben Milliliter 0,1-molarer Natriumchloridlösung und sieben Milliliter eiskaltem, 60 Gew.-%igen Saccharoselösung resuspendiert.

Nach einer 15-minütigen Inkubation auf Eis werden die Würmer erneut pelletiert. Nun schwimmen bakterienfreie Würmer auf, werden gesammelt, in RNA-freiem Wasser gewaschen und erneut pelletiert. Danach wird das saubere, locker kompakte Pellet in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt und 30 Sekunden bei maximaler Drehzahl zentrifugiert.

Angezogen und in 10 Volumina RNA later bei vier Grad Celsius gelagert, bis die Weiterverarbeitung erfolgt. Um Gesamt-RNA-Proben vorzubereiten, die vorbereiteten Pellets bei maximaler Drehzahl zentrifugieren, das Überstand entfernen und eine Prise molekulare Mahlharze zum Pellet hinzufügen. Anschließend das Gemisch unter Verwendung von flüssigem Stickstoff mit einem Stößel einfrieren.

Zerkleinern Sie die gefrorene Wurmsuspension unter Zugabe von flüssigem Stickstoff nach Bedarf, um das Pulver nach dem Mahlen kalt zu halten, zu einem feinen Pulver. Stellen Sie das Extrakt fünf Minuten lang auf Eis. Nach fünf Minuten mischen Sie das Extrakt mit 700 Mikrolitern R-L-T-B-M-E und insgesamt 472 Mikrolitern 100 %igem Ethanol.

RNA kann nun mithilfe eines im Handel erhältlichen Kits isoliert werden, wobei ein Endvolumen von 60 Mikrolitern isolierter RNA pro biologischer Probe erreicht wird. Vor dem Fortfahren sollte eine mögliche genomische DNA-Kontamination durch Behandlung mit DNAS1 entfernt werden, gefolgt von der Verwendung eines im Handel erhältlichen RNA-Reinigungskits. Schließen Sie das Kit ab, indem Sie auf ein Volumen von 60 Mikrolitern verweisen.

Schließlich die RNA-Konzentration bestimmen und die Integrität der RNA durch Behandlung mit Glyoxal, Probenauftragung, Farbstoff- und Gelelektrophorese vor der Mikroarray-Hybridisierung bewerten. Mit herkömmlichen Methoden gereinigte RNA wird in komplementäre DNA zurücktranskribiert, die mithilfe eines im Handel erhältlichen Kits von der abgebauten Vorlage gereinigt und auf ein Volumen von 60 Mikrolitern aufkonzentriert. Beginnen Sie die Mikroarray-Hybridisierung mit der Blockierung der See-Elegance-Mikroarray-Slides mit sonifizierter Lachssperma-DNA. Nach einer Stunde die blockierten Slides in zweifach destilliertem Wasser spülen und zentrifugieren.

Trocknen Sie die Objektträger in 50-Milliliter-Konischen Röhrchen, die mit einem Kim-Tuch ausgepolstert sind. Bereiten Sie nun einen zwei x Formamid-basierten Hybridisierungspuffer vor. Erwärmen Sie diesen zunächst 10 Minuten lang auf 55 Grad Celsius, um die Kristalle vollständig aufzulösen.

Zentrifugieren Sie die Probe anschließend eine Minute lang bei 10.000 × g. Mischen Sie danach 25 Mikroliter CD-Na mit 25 Mikrolitern Hybridisierungspuffer und schwenken Sie das Gemisch vorsichtig. Führen Sie nun eine kurze Zentrifugation des Gemischs durch und inkubieren Sie es 10 Minuten lang bei 80 Grad Celsius.

Nach der Inkubation das gesamte cDNA-Probe vorsichtig per Pipette auf den Microarray-Objektträger geben, ohne den Objektträger zu berühren. Um die Probe gleichmäßig auf dem Microarray-Objektträger zu verteilen, eine Deckglasabdeckung vorsichtig mit einer Spritzennadel absenken. Bevor das Deckglas vollständig abgesenkt ist, leicht anheben und erneut mit der Nadel absenken, sodass das Deckglas sanft an seinen Platz fällt.

Diese Technik minimiert die Bildung von Luftblasen. Legen Sie nun den Objektträger horizontal in ein 50-Milliliter-Kegelrohr unterhalb des Objektträgers mit 50 Mikrolitern zweifach destilliertem Wasser und lassen Sie ihn über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Tag wird eine zweite Hybridisierung kurz durchgeführt, nachdem der Objektträger gewaschen wurde.

Mehrmals in SSC wird der zweite Puffer, der lichtempfindliche Capture-Reagenzien und ein Antifa-Reagenz enthält, mit derselben Technik aufgetragen, gefolgt von einer kurzen Inkubation, weiteren Waschschritten und Trocknung. Danach kann der Objektträger gescannt werden. Die Bilder können mit der kostenlosen Software mit Open-Source-Magic-Tool analysiert werden.

Kurz gesagt: Erstellen und speichern Sie unter der Registerkarte Projekt ein neues Projekt im Bereich Ausdrucksprofil erstellen, wählen Sie Bildpaar laden aus und weisen Sie die rote Bilddatei als rot und die grüne Bilddatei als grün zu. Wechseln Sie dann zur Registerkarte Ausdrucksprofil erstellen. Wählen Sie Genliste laden, um eine C. elegans-Genlistendatei von der GCAT-Website hochzuladen, um das Microarray-Bild zu adressieren und zu rastern.

Wählen Sie die Registerkarte „Build Expression Profile“ und die Option „Editiergitter erstellen“. Bearbeiten Sie nun das Gitter. Richten Sie das Dialogfeld ein, indem Sie 48 für die Anzahl der Gitter festlegen, 22 Zeilen und 22 Spalten für jedes Gitter vorgeben und auswählen, dass die Stellen von links nach rechts und von oben nach unten nummeriert werden sollen.

Erhöhen Sie die prozentuale Kontraständerung und zoomen Sie in das Raster hinein, bis die einzelnen Flecken leicht zu unterscheiden sind. Erstellen Sie die Raster, indem Sie im linken Bedienfeld den oberen linken Fleck festlegen und dann auf die Mitte des oberen linken Flecks klicken, gefolgt vom oberen rechten Fleck und der unteren Zeile im ersten Raster. Wiederholen Sie diesen Rastererstellungsprozess für jedes der 48 Raster von links nach rechts und von oben nach unten.

Danach speichern, indem Sie den Dateireiter auswählen und das aktuelle Raster einmal gespeichert „aktuelles Raster speichern“ auswählen. Wählen Sie den Reiter „Fertig“, um alle nicht relevanten Stellen aus der Analyse auszuschließen. Öffnen Sie den Reiter „Expressionsprofil erstellen“ und wählen Sie unter der Option „Rasterung adressieren“ die Option „Spot-Markierung“.

Markieren Sie nun alle Strichmuster oder Hintergrundfluoreszenz und speichern Sie, indem Sie „aktuellen Markierungen speichern“ auswählen. Wie unter dem Datei-Tab sollten die markierten Dateien segmentiert werden. Abschließend analysieren Sie Gene, die durch einen bestimmten Faktor induziert oder unterdrückt werden, indem Sie unter dem Expressions-Tab „erkunden“ auswählen.

Legen Sie im Dialogfeld „Explorieren“ die Feinabstimmungskriterien für Gene fest. Die Anzahl der zweifachen Zunahmen oder Abnahmen der Expression. Die Intensität ist als x bekannt, und der Wert von x ist das Kriterium für die Expressionsänderung.

X wird eingegeben mit einem Maximalwert größer als X für induzierte Gene und einem Minimalwert kleiner als X für reprimierte Gene. In diesem Experiment wird eine Farbstoffwechselkontrolle durchgeführt: zwei unabhängige Gesamt-RNA-Isolierungen aus Larvenstadium drei und Larvenstadium vier werden entweder als grüner Mutant gegen roten Wildtyp oder als roter Mutant gegen grünen Wildtyp hybridisiert, um die Genexpressionsänderungen zu bestätigen. Führen Sie drei unabhängige Gesamt-RNA-Isolierungen mit dem gleichen Verfahren durch, synthetisieren Sie cDNA mit einem im Handel erhältlichen Kit und führen Sie für jede cDNA-Probe eine Echtzeit-PCR in Triplikaten unter Verwendung von drei Housekeeping-Genen als Kontrollen durch. Zur Demonstration untersuchen die folgenden Ergebnisse die in VSM1 induzierte Genexpression.

AK 1468-Mutanten sind ein Nematodenstamm, der durch eine verstärkte synaptische Aktivität gekennzeichnet ist. Vor der Durchführung der Microarray-Analyse wird die Qualität der extrahierten RNA mittels Gelelektrophorese überprüft. Das Vorhandensein zweier intakter ribosomaler Untereinheiten vor und nach der Dase-eins-Behandlung deutet auf eine qualitativ gute RNA-Probe hin. Im Microarray wird die cDNA des Wildtyps rot und die cDNA der VSM-eins-Mutante grün markiert. In diesem einen von 48 pro Microarray analysierten Rastern repräsentiert jedes kleine Quadrat ein einzelnes gedrucktes Oligonukleotid. In jedem Array ist jedes einzigartige Oligonukleotid vertreten.

Sobald die Microarray-Analyse von Transkripten, die aus Larven des vierten Stadiums isoliert wurden, zeigt, dass Gene, die für die major sperm proteins oder MSP kodieren, in VSM-one-Mutanten induziert sind, offenbart die Microarray-Analyse von Larven des dritten Stadiums ebenfalls Expressionsänderungen innerhalb derselben Genfamilie bei den Mutanten. Die Überprüfung der Vorhersagen aus dem Microarray mittels Echtzeit-PCR-Analyse zeigt, dass ein Mitglied der MSP-Genfamilie, MSP-32, in den VSM-one-Mutanten induziert ist. Die Daten stellen den Durchschnitt von drei Wiederholungen der Echtzeit-PCR aus derselben RNA-Präparation dar.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man bioinformatische Werkzeuge für genomweite Analysen handhabt, zumal der wissenschaftlichen Gemeinschaft viele Open-Source-Bioinformatik-Softwareprogramme zur Verfügung stehen.